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水稻OsTOM3基因克隆及OsTOM3沉默转基因植株的构建

作　者: 彭靖茹
导　师: 陈保善
学　校: 广西大学
专　业: 微生物学
关键词: 水稻转基因 OsRTOM3 寄主因子 基因沉默
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 34次
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内容摘要


根据本实验室已克隆的与拟南芥TMV寄主因子AtTOM3有高度同源性的水稻OsTOM3基因的全长cDNA序列设计3对特异性引物，用PCR的方法获得水稻OsTOM3全长基因。该基因长5329bp，包含有11个外显子和10个内含子。将构建以OsTOM3为靶标的RNA表达载体(RNA干扰表达载体、RNA反义表达载体及RNA正义表达载体)导入农杆菌EHA105中，并用其侵染水稻台北309的愈伤组织。共获得了38株带标记潮霉素抗性的转基因植株。转基因植株中能扩增潮霉素抗性基因和出NOS基因。测序表明所扩增的潮霉素基因序列与载体的潮霉素抗性基因的序列是一致的。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-5
目录  5-9
第一章 前言  9-32
  1.1 水稻病毒病及传统防治方法  9-10
  1.2 根癌农杆菌介导水稻的遗传转化  10-13
    1.2.1 根癌农杆菌介导的水稻遗传转化历史回顾  10-11
    1.2.2 植物转基因研究中常用的农杆菌菌株及特征  11
    1.2.3 影响根癌农杆菌介导的水稻转化的因素  11-13
      1.2.3.1 农杆菌菌株的类型  11
      1.2.3.2 农杆菌菌株高侵染活力的生长时期及有效去除  11
      1.2.3.3 转化受体  11-12
      1.2.3.4 酚类化合物的影响  12-13
      1.2.3.5 启动子  13
      1.2.3.6 培养基  13
  1.3 植物抗病毒的研究现状  13-18
    1.3.1 利用来源于病毒自身的基因或基因的调控系统来获得抗病毒植株  13-17
      1.3.1.1 衣壳蛋白基因  13-14
      1.3.1.2 复制酶基因  14-15
      1.3.1.3 移动蛋白基因  15-16
      1.3.1.4 反义RNA技术  16
      1.3.1.5 缺陷干扰型RNA  16
      1.3.1.6 RNAi技术  16-17
      1.3.1.7 核酶  17
    1.3.2 非病毒基因提供的抗性  17-18
      1.3.2.1 干扰素  17
      1.3.2.2 抗体基因  17-18
      1.3.2.3 其它的抗植物病毒的抑制剂  18
      1.3.2.4 利用水稻体内存在的抗病毒基因  18
  1.4 植物病毒的寄主因子  18-23
    1.4.1 与RNA病毒复制相关寄主因子的发现  19-20
    1.4.2 研究植物RNA病毒寄主因子基因的两个模式系统  20-21
      1.4.2.1 拟南芥／烟草花叶病毒系统  20
      1.4.2.2 酵母／雀麦花叶病毒系统  20-21
    1.4.3 现已证实功能的植物RNA病毒寄主因子  21-23
      1.4.3.1 AtTOM1基因  21
      1.4.3.2 AtTOM2基因  21
      1.4.3.3 AtTOM3基因  21-22
      1.4.3.4 果胶甲酯酶(pectin methylesterase,PME)基因  22
      1.4.3.5 VSM1基因  22
      1.4.3.6 CUM1和CUM2基因  22
      1.4.3.7 LSM1基因  22-23
      1.4.3.8 OLE1基因  23
      1.4.3.9 YDJ1基因  23
      1.4.3.10 Dedlp基因  23
  1.5 基因沉默  23-30
    1.5.1 转录后基因沉默——植物防御病毒的一种机制  24-25
    1.5.2 RNA沉默和RNA介导的病毒抗性的作用机制  25-27
    1.5.3 病毒诱导的基因沉默(VIGS)机制  27-28
    1.5.4 RNA沉默的功能  28-29
    1.5.5 基因沉默的方法  29-30
      1.5.5.1 反义RNA技术  29-30
      1.5.5.2 RNA干涉技术  30
      1.5.5.3 病毒诱导的基因沉默  30
  1.6 本研究的目的及意义  30-32
第二章 材料与方法  32-44
  2.1 材料  32-36
    2.1.1 植物材料  32
    2.1.2 菌株与质粒  32-33
      2.1.2.1 菌株及质粒  32-33
      2.1.2.2 菌株培养条件  33
      2.1.2.3 菌种保存  33
    2.1.3 抗生素  33-34
    2.1.4 酶、化学试剂  34
    2.1.5 常用溶液配制  34
    2.1.6 培养基  34-36
  2.2 分子生物学操作  36-40
    2.2.1 水稻总DNA的提取(CTAB法)  36
    2.2.2 引物设计  36-37
    2.2.3 PCR反应  37
    2.2.4 质粒DNA的转化  37-38
      2.2.4.1 RbCl_2制备大肠杆菌感受态细胞  37-38
      2.2.4.2 质粒DNA的热冲击转化  38
    2.2.5 质粒DNA的提取  38-39
    2.2.6 三亲结合法向农杆菌导入目的质粒  39
    2.2.7 内切酶反应  39
    2.2.8 从凝胶中回收目的DNA片段  39-40
    2.2.7 载体的脱磷酸化处理  40
    2.2.8 突出DNA片段末端的补平  40
    2.2.9 DNA连接反应  40
  2.3 水稻的遗传转化  40-44
    2.3.1 水稻组织培养和转化的培养基  40-41
    2.3.2 水稻种子的灭菌  41
    2.3.3 愈伤组织的诱导与继代  41-42
    2.3.4 水稻转化的基本程序  42
    2.3.5 根癌农杆菌的培养  42
    2.3.6 共培养  42
    2.3.7 筛选培养  42
    2.3.8 抗性愈伤组织预分化  42
    2.3.9 抗性愈伤组织分化成小苗  42-43
    2.3.10 抗性植株壮苗、炼苗及移栽  43
    2.3.11 转基因的水稻的PCR检测  43-44
      2.3.11.1 用于PCR检测转基因水稻的总DNA的微量提取  43
      2.3.11.2 转基因植株的PCR检测引物设计  43
      2.3.11.3 PCR产物的测序  43-44
第三章 结果与分析  44-68
  3.1 水稻OsTOM3全长基因的克隆及反义表达载体的构建  44-50
    3.1.1 OsTOM3全长基因的PCR克隆  44-46
    3.1.2 OsTOM3全长基因的序列分析  46-47
    3.1.3 重组质粒的连接  47-48
    3.1.4 OsTOM3基因组反义表达载体的构建  48-49
    3.1.5 OsTOM3反义RNA表达质粒导入农杆菌EHA105  49-50
  3.2.水稻OsTOM3 RNAi表达质粒的构建  50-54
    3.2.1 水稻OsTOM3 RNAi重组质粒的构建  50-52
    3.2.2 OsTOM3 RNAi表达质粒的构建  52-53
    3.2.3 OsTOM3 RNAi表达质粒导入农杆菌EHA105  53-54
  3.3 OsTOM3 cDNA正义及反义表达载体的构建  54-56
    3.3.1 OsTOM3 cDNA PCR扩增  54
    3.3.2 OsTOM3 cDNA重组质粒鉴定  54
    3.3.3 OsTOM3 cDNA正义及反义表达载体的构建  54-56
    3.3.4 OsTOM3 cDNA正义及反义表达载体导入农杆菌EHA105  56
  3.4 OsTOM3基因表达重组质粒对水稻台北309的转化  56-64
    3.4.1 根癌农杆菌介导的水稻TP309转化条件的建立  56-59
      3.4.1.1 2,4-D对水稻诱导愈伤组织的影响  56-57
      3.4.1.2.水稻愈伤组织对潮霉素的敏感性试验  57-58
      3.4.1.3 不同的侵染时间对台北309愈伤组织的影响  58-59
    3.4.2 水稻OsTOM3基因对TP309的转化及再生  59-64
      3.4.2.1 转化受体的准备  59-60
      3.4.2.2 对水稻的转化和筛选  60-61
      3.4.2.3 拟转基因植株的获得  61-63
      3.4.2.4 白化苗的产生及原因分析  63-64
  3.5 转基因植株的鉴定和转化效率的分析  64-68
    3.5.1 转化效率的分析  64
    3.5.2 转基因植株的检测  64-68
      3.5.2.1 台北309转基因植株的PCR检测  64-66
      3.5.2.2 台北309转基因植株的PCR产物序列  66-68
第四章 讨论  68-71
  4.1 水稻OsTOM3基因  68-69
  4.2 水稻的遗传转化  69
  4.3 结论  69-71
参考文献  71-77
附录A 实验中用到的主要仪器  77-78
致谢  78-79
攻读学位期间发表的学术论文目录  79

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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