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我国产意大利蜂蜂毒多肽的分离纯化、结构鉴定、活性测定以及固相合成研究

作　者: 孟迂
导　师: 于德泉
学　校: 北京协和医学院
专　业: 药物化学
关键词: 蜂毒离子通道活性蜂毒成分固相合成
分类号: R914
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

蜂毒毒素是我国传统中药的宝贵资源,中医认为它具有祛风、止痛、平喘的功效,可用于治疗风湿、类风湿性关节炎,神经炎,皮肤病等疾病。近年来,还有蜂毒制剂用于治疗老年痴呆及抗抑郁的专利报道。现已证明,蜂毒具有多种药理活性：在中枢神经系统中有抗胆碱活性,镇静和镇痛作用；在呼吸及心血管系统中可产生呼吸加快、扩张血管、降低血压、抗心律失常、改善冠状动脉供血和微循环的作用；还具有抗炎、抗菌、溶血、抗凝血、抗病毒以及防辐射等作用。蜂毒毒素已经被证明是多种离子通道的配体,是阐明多种离子通道的结构和功能的有力工具。目前,蜂毒多肽组分在我国已经成为上市药物,用于治疗风湿类疾病和周围神经炎。为研究考察我国产意大利蜂(Apis mellifera)蜂毒成分、寻找新型的离子通道配体以及高效低毒的活性多肽,本文对蜂毒毒素的化学成分进行了研究,并初步测定部分多肽对钠和钾电流的影响。1.综合运用多种色谱技术,从我国产意大利蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒中共分离得到10个蜂毒毒素,通过FTICR等质谱、氨基酸分析、Edman降解等方法确定了这些蜂毒毒素的一级结构,其中3个为新的蜂毒毒素,分别命名为melittin F1, secapin-1和secapin-2。secapin-1、secapin-2与已知多肽secapin的区别主要集中在第4位,第16位及第19位氨基酸残基上。2.另有5个蜂毒毒素通过测定LC-ESI-Q-TOF的二级质谱数据并结合数据库检索得到鉴定,分别命名为melittin F2, melittin F3, melittin F4, melittin及melittin-G,其中melittin为已知多肽,其它4个多肽尚无天然存在的报道。3.应用HPLC/FTICR-MS分析技术,建立了蜂毒的多肽指纹图谱。并对其中多肽的分子量进行了归属。结果表明此种蜂毒中多为小分子量多肽,分子量范围主要在1000-3500之间。能检测到的分子量大于5000的多肽数量较少。结合分离得到的多肽纯品信息和相关文献及应用HPLC/FTICR-MS分析获得的HRMS信息,指认了蜂毒中多肽成分指纹图谱中9个主要色谱峰。4.电生理活性测定发现3个已知蜂毒毒素secapin, Api m6.01, Api m6.03对钠、钾通道有一定的作用。5.通过固相合成的方法合成并纯化得到C端酰胺化的secapin-1新多肽。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
前言  9-11
第一章意蜂毒素研究概况  11-25
  一、意蜂蜂毒的理化性质  11-12
  二、意蜂蜂毒的成分  12-23
    (一) 意蜂蜂毒中肽类成分及其药理作用  12-22
      1. 蜂毒溶血肽(melittin)及其药理作用  12-14
      2. Melittin F及其药理作用  14
      3. 蜂毒明肽(Apamin)及其药理作用  14-17
      4. MCD多肽(401肽；MCD peptide)及其药理作用  17-19
      5. 蜂毒镇静肽(Secapin)及其药理活性  19-20
      6. Tertiapin(TNP)及其药理作用  20-21
      7. Adolapin及其药理作用  21
      8. Procamine  21
      9. Api M6  21-22
      10 蜂毒中其它肽类物质  22
    (二) 蜂毒中的酶类成分简介  22-23
      1. 磷脂酶A_2  22-23
      2. 透明质酸酶（Hyaluronidase, Hya,)  23
  三、蜂毒疗法简介  23-24
  四、总结  24-25
第二章蜂毒多肽的分离、纯化、结构鉴定及LC-MS方法的建立  25-71
  一、原料、主要仪器和试剂  25-26
  二. 实验方法及原理  26-30
  三、蜂毒多肽LC-LTQ-FT方法研究  30-35
    3.1 样品制备  30
    3.2 HPLC/FTICR-MS分析条件  30
    3.3 蜂毒多肽HPLC分析方法的确定  30-33
    3.4 蜂毒中多肽成分谱色谱峰的指认  33-35
  四、蜂毒中多肽成分的分离纯化及结构鉴定  35-71
    (一) 蜂毒中多肽成分的分离纯化  35-41
      1 提取  35
      2 分离纯化  35-41
        2.1 BV-2组分中多肽的HPLC分离纯化  36-37
        2.2 BV-5组分中多肽的HPLC分离纯化  37-38
        2.3 BV-7组分中多肽的HPLC分离纯化  38-39
        2.4 BV-8组分中多肽的HPLC分离纯化  39-41
    (二) 蜂毒多肽的结构鉴定  41-63
      1. BV-5-4-3(新多肽)的结构鉴定  42-44
      2. BV-5-4-4(新多肽)的结构鉴定  44-46
      3. BV-7-3(新多肽)的结构鉴定  46-49
      4. BV-2-7(Apamin)的结构鉴定  49-51
      5. BV-5-2(tertiapin)的结构鉴定  51-52
      6. BV-5-1(tertiapin oxidized)的结构鉴定  52-54
      7. BV-5-3-3(Api m6.01)的结构鉴定  54-56
      8. BV-5-4-2(Secapin)的结构鉴定  56-58
      9. BV-5-5(Api m6.03)的结构鉴定  58-61
      10. BV-8-2(melittin)的结构鉴定  61-63
    (三) BV-9组分的LC-ESI-Q-TOF分析  63-71
      1 分析条件  63
      2 分析结果  63-71
第三章 SECAPIN-1的固相合成研究  71-79
  一、常用试剂及检测反应  71
    1、试剂配制  71
    2、氨基定性反应  71
  二、合成实验  71-73
    1、树脂的选择及活化处理  71
    2、Fmoc-AA-OH与树脂的键合  71-72
    3、微波辅助脱Fmoc保护基  72
    4、树脂上多肽的裂解  72-73
  三、SECAPIN-1二硫键的形成  73-74
  四、SECAPIN-1的纯化  74-78
    1、secapin-1 Protein Pak 60柱的纯化  75-76
    2、组分Ⅰ的离子交换柱纯化  76
    3、组分Ⅱ的离子交换柱纯化  76-77
    4、组分Ⅲ的RP-HPLC纯化  77-78
  五、结果及得率  78-79
第四章部分蜂毒多肽的电生理活性测定  79-83
  一、实验方法  79
  二、实验结果  79-82
  小结  82-83
第五章结果与讨论  83-85
  一、关于蜂毒毒素LC-LTQ-FT分析方法的建立  83
  二、关于蜂毒毒素的结构及活性  83-84
  三、关于固相合成SECAPIN-1  84-85
参考文献  85-93
致谢  93-94
附图  94-130

我国产意大利蜂蜂毒多肽的分离纯化、结构鉴定、活性测定以及固相合成研究

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