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1、第一部分 芳香类化合物异戊烯基转移酶BuPT的功能及杂泛性 2、第二部分 紫杉烷类化合物的微生物转化及肿瘤多药耐药逆转活性

作　者: 刘晓
导　师: 戴均贵
学　校: 北京协和医学院
专　业: 生药学
关键词: 异戊烯基转移酶BuPT 底物杂泛性 异戊烯基芳香类化合物 酶法合成 紫杉烷类化合物 多药耐药(MDR)逆转剂 微生物转化
分类号: R284.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


第一部分芳香类化合物异戊烯基转移酶BuPT的功能及杂泛性芳香类化合物异戊烯基转移酶是一类参与众多活性异戊烯基芳香类化合物生物合成的关键酶。本研究在生物信息学分析的指导下,从土曲霉(Aspergillus terreusA8-4)中克隆得到新型芳香类化合物异戊烯基转移酶基因BuPT,体外功能鉴定发现重组BuPT能够催化(+)-butyrolactone Ⅱ异戊烯基化反应生成(+)-butyrolactone Ⅰ,为首个发现的参与(+)-butyrolactone Ⅰ生物合成相关异戊烯基化反应的基因；进一步研究发现BuPT具有惊人的底物杂泛性,能够识别多种不同结构类型芳香类化合物异戊烯基受体及多种不同数目C5单元异戊烯基供体(DMAPP (C5)、GPP(10)、 FPP (Ci5)、PPP (C20))催化异戊烯基化反应,其中对木脂素类化合物、黄酮苷类化合物、二苯甲酮类化合物、香豆素类化合物、curcuminoids类化合物及苯乙基色原酮类化合物的异戊烯基化均为首次报道；将BuPT应用于多种异戊烯基芳香类化合物的酶法合成,得到多个新颖结构异戊烯基芳香类化合物；通过蛋白结构的X-ray单晶衍射分析初步明晰了BuPT催化异戊烯基化反应杂泛性的结构基础。结果提示,新型异戊烯基转移酶BuPT所具有的惊人的杂泛性使得其有望作为一种良好的工具酶应用于多种不同结构类型异戊烯基芳香类化合物的酶法合成,也可作为一种通用的功能元件应用于天然产物或非天然产物合成生物学次级代谢途径的人工构建,从而发现药物先导物应用于创新药物的研制。具体研究结果如下：1、土曲霉A8-4中异戊烯基转移酶基因BuPT的克隆与功能鉴定在生物信息学分析指导下,通过引物设计、RT-PCR从土曲霉A8-4基因组中克隆得到八条可溶性假定芳香类化合物异戊烯基转移酶基因；进一步构建重组表达载体实现了基因BuPT在大肠杆菌中的可溶性表达,体外功能鉴定发现,重组BuPT蛋白能够以DMAPP为供体催化(+)-butyrolactone Ⅱ异戊烯基化生成(+)-butyrolactoneⅠ,为首个发现的参与(+)-butyrolactone Ⅰ生物合成相关异戊烯基化反应的基因。2、重组BuPT催化异戊烯基化反应底物杂泛性对新型异戊烯基转移酶BuPT催化异戊烯基化反应的底物杂泛性进行了研究,结果发现重组BuPT表现出惊人的底物选择杂泛性：异戊烯基受体选择性方面,在所试验的包括(+)/(-)-butyrolactone Ⅱ.类黄酮类化合物(黄酮类、二氢黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮醇类、异黄酮类、二氢异黄酮类、查尔酮类、二氢查尔酮类和黄酮苷类化合物)、xanthones类化合物、二苯甲酮类化合物、木脂素类化合物、香豆素类化合物、curcuminoids类化合物、苯乙基色原酮类化合物、二苯乙烯类化合物、吲哚类化合物(二酮哌嗪类化合物、色氨酸衍生物)、蒽醌类化合物、羟基萘类化合物、萘醌类化合物、简单酚酸类化合物及芳香氨基酸类化合物在内的23种结构类型共计102种芳香类化合物中,有21类共计65种化合物均能被重组BuPT催化发生异戊烯基化反应,生成多个在不同位点引入一个或同时引入多个异戊烯基取代的化合物,产物多样性丰富,产率较高,其中对木脂素类化合物、黄酮苷类化合物、二苯甲酮类化合物、香豆素类化合物、curcuminoids类化合物及苯乙基色原酮类化合物的异戊烯基化均为首次报道；异戊烯基供体选择性方面,重组BuPT能接受不同数目C5单元的DMAPP(C5).GPP(C10)、FPP(C15)或PPP(C20)为异戊烯基供体,催化包括(+)/(-)-butyrolactone Ⅱ在内的多种类型芳香类化合物异戊烯基化反应,表现出明显的供体选择杂泛性。上述BuPT所具有的供体/受体杂泛性在异戊烯基转移酶中是非常罕见的。3、应用重组BuPT合成新颖结构异戊烯基芳香类化合物分别选择能被重组BuPT催化的阳性芳香类底物中具有不同结构类型及特征的木脂素类化合物(+)/(-)-butyrolactone Ⅱ,二酮哌嗪类化合物cyclo-(L-Trp-L-Trp),黄酮苷类化合物genistin.二氢异黄酮类化合物maackiain及香豆素类化合物7.hydroxycoumarin共6种芳香类化合物为异戊烯基受体,以GPP为异戊烯基供体,对相应异戊烯基化产物进行了酶法合成、分离纯化及结构鉴定。共分离得到17个酶促异戊烯基化产物,均为新颖结构异戊烯基芳香类化合物。产物结构解析发现,BuPT可以催化芳香化合物骨架上不同位点的异戊烯基化,且能同时催化多个异戊烯基取代反应的发生,从反应类型来讲,BuPT既能催化C-异戊烯基化,也能够催化O-异戊烯基化反应。重组BuPT蛋白X-ray晶体结构分析结果显示：BuPT三维结构中所具有的宽松的底物结合腔可能为其拥有明显底物杂泛性的结构基础。4、重组BuPT蛋白催化(+)/(-)-butyrolactone Ⅱ异戊烯基化的反应特性研究对BuPT催化(+)/(-)-butyrolactone Ⅱ异戊烯基化反应特性研究发现：1、反应不需要Mg2+等二价阳离子的参与；2、重组蛋白最佳反应pH值为pH7.0左右；3、以(+)-butyrolactone Ⅱ为异戊烯基受体,以GPP为异戊烯基供体时,重组蛋白最佳反应温度为50℃左右,反应转化率在60min内呈线性增长；以(-)-butyrolactone Ⅱ为异戊烯基受体,以GPP为异戊烯基供体时,重组蛋白最佳反应温度为25-42℃之间,反应转化率在30min内呈线性增长；4、通过计算米氏常数(Km),酶反应最大速率(Vmax)对重组BuPT以DMAPP.GPP为供体,分别催化(+)/(-)-butyrolactoneⅡ异戊烯基化反应进行了酶反应动力学分析,结果显示GPP供体的Km值远小于DMAPP供体的Km值,说明BuPT对GPP的亲和力远高于对DMAPP的亲和力。第二部分紫杉烷类化合物的微生物转化及肿瘤多药耐药逆转活性肿瘤细胞对某一化疗药物产生耐药后,对其它化学结构及作用机理不同的化疗药物产生交叉耐药的现象,称为“多药耐药”(multi-drug resistance,MDR)。多药耐药的发生是导致肿瘤临床治疗失败的主要原因,寻找新型肿瘤多药耐药逆转剂是克服肿瘤MDR的主要途径之一。本课题组前期对源自红豆杉组织细胞培养物中的sinenxan系列化合物进行了大量的衍生化工作,获得了一系列具有较好逆转活性的先导化合物并进行了构效关系研究。在此基础上,本课题通过生物转化对两个活性较强的sinenxan A衍生物A1和A2进行了进一步结构优化,获得了大量具有新颖结构的衍生物,包括一个新型紫杉烷骨架类型化合物,实现了许多化学方法难以实现的反应。药理活性评价结果表明多个衍生物具有良好的多药耐药逆转活性,显示了生物转化是实现复杂结构天然产物衍生化的有力手段。具体研究结果如下：1、化合物A1、A2的微生物转化初筛以具良好多药耐药逆转活性的化合物A1[10-oxo-2a,5α,14β-triacetoxytaxa-4(20),11(12)-diene]和A2[5a-hydroxy-10p-methoxy-2α,14a-diacetoxytaxa-4(20),11(12)-diene]作为底物,利用十余种生物转化常用菌株分别对其进行了微生物转化筛选,结合TLC、HPLC分析筛选得到4种转化率较高、产物多样性较好的微生物。其中刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata CGMCC3.3400)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus CACC200300)、绛红诺卡氏菌(Nocardia purpurea CGMCC4.1182)对A1具有良好的转化能力；刺孢小克银汉霉(C. echinulata CGMCC3.3400)、黑曲霉(Aspergillus niger Van Tieghem CGMCC3.1858)、灰色链霉菌(S. griseus CACC200300)、绛红诺卡氏菌(N. purpurea CGM.CC4.1182)对A2具有良好的转化能力。2、化合物A1的制备生物转化利用上述三种微生物对A1分别进行了制备生物转化,通过各种色谱技术及波谱手段对产物进行了分离纯化及结构鉴定,制备得到10个转化产物,均为新化合物,结构分别鉴定为：5α-hydroxy-10-oxo-2α,14β-diacetoxytaxa-4(20),11(12)-diene (A3),5a,6a-dihydroxy-10-oxo-2α,14β-diacetoxytaxa-4(20),11(12)-diene (A4),5α-hydroxy-10-oxo-2α,6α,14β-triacetoxytaxa-4(20),11(12)-diene (A5),7β-hydroxy-10-oxo-2α,5α,14β-triacetoxytaxa-4(20),11(12)-diene (A6),5α,7β-dihydroxy-10-oxo-2α,14β-diacetoxytaxa-4(20),11(12)-diene (A7),9α-hydroxy-10-oxo-2α,5α,14β-triacetoxytaxa-4(20),11(12)-diene (A8),9β-hydroxy-10-oxo-2α,5α,14β-triacetoxytaxa-4(20),11(12)-diene (A9),9β,18-dihydroxy-10-oxo-2α,5α,14β-triacetoxytaxa-4(20),11(12)-diene (A10),10α,18-epoxy-10β-hydroxy-9-oxo-2α,5α,14β-triacetoxytaxa-4(20),11(12)-diene (A11),5α,14β-dihydroxy-10-oxo-2α-acetoxytaxa-4(20),11(12)-diene(A12)；反应类型多种多样,包括不同位点的羟基化、乙酰化、去乙酰化、羰基化、羟醛缩合反应等等。值得一提的是,灰色链霉菌(S. griseus)对A1转化体系中得到了新型紫杉烷骨架类型化合物Furantaxane (A11),多种波谱数据结合X-ray单晶衍射分析显示其在C12-C18-O-C10-C11之间形成了五元呋喃环,组成了一个全新的6/8/6/5元环系结构,并对其可能的生物合成途径进行了假设。3、化合物A2的制备生物转化利用上述四种微生物对A2分别进行了制备生物转化,通过各种色谱技术及波谱手段对产物进行了分离纯化及结构鉴定,制备得到14个转化产物,其中6个为新化合物,结构分别鉴定为5α,9α-dihydroxy-10β-methoxy-2α,14β-diacetoxytaxa-4(20),11(12)-diene (A13),5α,9α,10β-trihydroxy-2α,14β-diacetoxytaxa-4(20),11(12)-diene (A14),5α,18-dihydroxy-10β-methoxy-2α,14β-diacetoxytaxa-4(20),11(12)-diene (A19),5α,10β,18-trihydroxy-2α,14β-diacetoxytaxa-4(20),11(12)-diene (A20),5α-hydroxy-2α,14β-diacetoxytaxa-4(20),11(12)-diene-10β-O-(butan-2-ol)-ether (A22),10β-methoxy-2α,5α,14β-trihydroxytaxa-4(20),11(12)-diene (24);反应类型多种多样,包括不同位点的羟基化、乙酰化、去乙酰化、甲基化、去甲基化、环氧化、羰基化、D-烷基化反应等等；在结构鉴定基础上对转化产物可能的生物合成途径进行了假设。4、转化产物体外肿瘤多药耐药逆转活性评价将分离得到的24个转化产物及底物A1、A2分别与紫杉醇(Paclitaxel)联合用药作用于人肺腺癌耐药细胞株A549/taxol进行体外肿瘤多药耐药(MDR)逆转活性评价。结果显示,多个转化产物较底物A1、A2相比,MDR逆转活性都有了明显提高：其中化合物A18对A549/taxol耐药细胞株肿瘤多药耐药逆转活性达到阳性药verapamil的2倍,是其底物A2的5倍之多；化合物A26对A549/taxol耐药细胞株肿瘤多药耐药逆转活性与阳性药verapamil相当,是底物A2的2倍；具有新颖6/8/6/5元紫杉烷环系的化合物Furantaxane (All)对A549/taxol耐药细胞株表现出与阳性药verapamil相当的逆转活性,是底物A1的2倍多。上述化合物都具有较低的肿瘤细胞毒性,提示其有望作为药物先导物研发成为新型紫杉烷类肿瘤多药耐药逆转剂。

全文目录


摘要  6-12
Abstract  12-18
缩略语表  18-19
材料、试剂与仪器设备  19-22
第一部分 芳香类化合物异戊烯基转移酶BuPT的功能及杂泛性  22-142
  引言  22-26
    参考文献  25-26
  综述：微生物源芳香类化合物异戊烯基转移酶研究进展  26-42
    参考文献  37-42
  第一章 土曲霉基因组中(+)-butyrolactone Ⅰ生物合成相关异戊烯基转移酶基因的挖掘  42-78
    前言  42
    结果及讨论  42-63
      1、土曲霉中(+)-butyrolactone Ⅰ生物合成相关异戊烯基转移酶性质初探  42-44
      2、土曲霉基因组中假定芳香类化合物异戊烯基转移酶生物信息学分析  44-48
      3、土曲霉中假定芳香类化合物异戊烯基转移酶基因的克隆及序列分析  48-53
      4、AtPT基因的表达、重组蛋白分离纯化及体外功能鉴定  53-57
      5、BuPT基因的表达、重组蛋白分离纯化及体外功能鉴定  57-63
    本章小结  63-64
    实验部分  64-76
    参考文献  76-78
  第二章 重组BuPT底物杂泛性研究及应用于酶法合成不同类型异戊烯基芳香类化合物  78-128
    前言  78-79
    结果及讨论  79-124
      1、重组BuPT受体选择杂泛性  79-109
      2、重组BuPT供体选择杂泛性  109-113
      3、应用重组BuPT酶法合成不同类型异戊烯基芳香类化合物  113-122
      4、重组BuPT反应杂泛性结构基础  122-124
    本章小结  124-125
    实验部分  125-126
    参考文献  126-128
  第三章 重组BuPT催化(+)/(-)-butyrolactoneⅡ异戊烯基化反应特性  128-140
    前言  128
    结果及讨论  128-135
      1、不同反应条件对异戊烯基化反应的影响  128-132
      2、酶促动力学分析  132-135
    本章小结  135
    实验部分  135-140
  总结与创新点  140-142
第二部分 紫杉烷类化合物的微生物转化及肿瘤多药耐药逆转活性  142-212
  引言  142-144
  综述：紫杉烷类多药耐药逆转剂的研究进展  144-162
    参考文献  157-162
  第一章 A1、A2的制备与微生物转化菌株筛选  162-174
    前言  162-163
    结果及讨论  163-171
      1、底物A1、A2的制备  163-165
      2、微生物转化菌株筛选  165-171
    本章小结  171
    实验部分  171-173
    参考文献  173-174
  第二章 A1、A2的制备微生物转化及产物多药耐药逆转活性评价  174-210
    前言  174-175
    结果及讨论  175-199
      1、A1的制备生物转化  175-189
      2、A2的制备生物转化  189-197
      3、转化产物体外肿瘤多药耐药(MDR)逆转活性评价  197-199
    本章小结  199
    实验部分  199-208
    参考文献  208-210
  总结与创新点  210-212
附图(化合物的NMR、MS、IR谱图)  212-292
  第一部分 附图  218-240
  第二部分 附图  240-292
个人简历  292-294
论文发表及参加会议  294-296
致谢  296-298

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药化学 > 有效成分的化学合成
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