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植物内生真菌来源抗菌物质的筛选及产ECB侧链酰胺水解酶基因工程菌的构建

作　者: 常青
导　师: 倪兵；陈代杰
学　校: 华东师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 内生真菌 MRSA ECB酰胺水解酶阿尼芬净微生物转化
分类号: R284.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)已成为医院感染的主要病原菌并遍布全世界,是临床抗感染治疗的难题。尽管现在有万古霉素、替考拉宁、利福平等一些治疗MRSA的药物,但MRSA通过多种机制产生耐药性,目前尚未研制出对MRSA强效的新型抗生素,寻找新的药物开发前体是亟待解决的问题。植物内生真菌普遍存在于健康植物组织中,种类繁多,具有多种多样的活性功能,其中很重要的一点就是抑菌作用。本实验室尝试从植物内生真菌当中寻找拮抗MRSA的活性菌株并研究发酵条件的最优化,为今后研制治疗MRSA的药物打下了工作基础。我们采用固体发酵的方法,对529株植物内生真菌(植物主要涉及柴胡、小麦、番茄、水稻、当归、千金藤、连翘、元宝草、朱砂根、杜仲、野鸡尾、牡丹、藿香等)进行培养,发酵周期为14 d,乙酸乙酯抽提发酵产物,并用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、白色念珠菌(Candidate albicans)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、藤黄八叠球菌(Sahroeter lutea)、大肠杆菌(Escherichia coli)5种常见病原菌作为鉴定菌,纸片琼脂扩散法检测所制备的发酵产物的抑菌活性。发现发酵产物抽提液抗大肠杆菌的菌株为50株、抗白色念珠菌的为66株、抗金黄色葡萄球菌的为262株、抗藤黄八叠球菌的为124株、抗枯草杆菌的为159株。又采用MRSA作为鉴定菌,选取了55株具有较广抑菌谱的植物内生菌进行复筛,结果显示19株具有抗MRSA活性。而后我们选取了1株具有广谱抗菌活性的内生真菌SIPI 3.0070进行菌种鉴定,该菌拮抗革兰氏阳性菌(包括MRSA)和真菌。通过形态和培养特性观察(3 d、7d菌落形态及显微形态),初步鉴定该菌属于曲霉菌属(Aspergillus)当中的烟曲霉,接着利用分子生物学方法,将SIPI 3.0070菌株的18S rDNA序列测序,并向GenBank进行了提交,其序列登记号为FJ864683,序列比对同源性最高的也是烟曲霉(同源性100%),最终鉴定SIPI 3.0070是烟曲霉。同时还对该菌培养及抽提条件进行了优化,以抑菌圈大小作为评判标准,结果显示以小米作为固体培养基,发酵周期14 d,采用乙酸乙酯抽提培养物,抽提液抗革兰氏阳性菌活性较高,采用甲醇抽提发酵物,抽提液抗真菌效果较高,本工作为进一步抽提该菌抗菌活性化合物奠定了基础。犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)发酵产生的酰胺水解酶,可以水解棘白菌素B0(简称ECB)的溶血性的亚油酰侧链而得到ECB母核,然后经过一系列的化学修饰,最终得到抗真菌药物阿尼芬净。查阅文献报道,目前我国基本采用游动放线菌发酵法来获取ECB酰胺水解酶,尚无相关的通过基因工程的方法获得ECB酰胺水解酶。由于基因工程方法运用成熟,且相对于传统发酵法,更加理性和定向,因此,建立基因工程程菌来产生ECB酰胺水解酶显得尤为重要。本实验室采用两种基因工程菌构建策略,一种策略是从保存的犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis) SIPI-A.2001基因组中克隆到ECB酰胺水解酶及其上下游基因(大约4 kb),EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切该基因与pSP72质粒,连接,构建成pCQ-02-44-1质粒,基因测序与网上相应ECB酰胺水解酶序列同源性达99.8%。接下来用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切出4 kb片段和pTGV2线性片段,连接,构建出含有ECB酰胺水解酶及上下游基因的pTGV2质粒,命名为pCQ-03-11-1,通过接合转移的方法将此表达质粒导入到模式变铅青链霉菌(Streptomyces lividans) TK24中,种子培养2 d,发酵培养5 d,离心清洗收集菌丝,静息细胞法转化ECB底物,转化时间5 h,转化温度30℃,底物浓度2mg/mL。HPLC检测表明,我们构建的基因工程菌可以有效水解ECB亚油酰侧链,最高转化率达53.2%,犹他游动放线菌转化率是11.74%,基因工程菌转化效率要比野生型游动放线菌转化率提高近5倍。另一种策略是只克隆ECB酰胺水解酶基因(大约2.8kb),网上序列比对同源性为99.8%,再克隆红霉素强启动子(ermEp)基因,序列比对同源性为100%,通过酶切连接,构建含有红霉素启动子和ECB酰胺水解酶的克隆质粒,导入到表达质粒pTGV2。另外我们还构建了含有ECB酰胺水解酶及其上下游基因的pSET152表达质粒,含有ECB酰胺水解酶及红霉素启动子的pTGV2表达质粒。本文工作为下一步利用基因工程菌转化ECB底物打下基础,探索了利用基因工程菌以高转化效率转化ECB的工业化途径。

全文目录

常青硕士学位论文答辩委员会成员名单  5-9
英文缩写说明  9-10
论文摘要  10-12
ABSTRACT  12-14
第1章绪论  14-30
  1.1 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的研究  14-17
    1.1.1 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生物学特征  14-15
    1.1.2 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药机制  15-16
    1.1.3 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法  16-17
    1.1.4 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的治疗  17
  1.2 药用植物内生真菌的研究  17-19
    1.2.1 药用植物内生真菌的多样性  18
    1.2.2 药用植物内生真菌的作用  18-19
  1.3 棘白菌素类药物的研究  19-24
    1.3.1 棘白菌素类药物家族  20-21
    1.3.2 棘白菌素类药物的临床应用  21-22
    1.3.3 阿尼芬净的研究  22-24
  1.4 酰胺水解酶的研究  24-27
    1.4.1 ECB酰胺水解酶简介  24-25
    1.4.2 ECB酰胺水解酶的主要功能与应用  25-27
  1.5 立题依据  27-30
第2章植物内生真菌来源抗菌物质筛选  30-41
  2.1 材料与仪器  30-32
    2.1.1 菌种  30
    2.1.2 培养基  30-31
    2.1.3 主要试剂及溶剂  31
    2.1.4 主要仪器设备  31-32
  2.2 实验方法  32-35
    2.2.1 内生真菌发酵  32
    2.2.2 固态发酵物抽提  32
    2.2.3 抑菌活性检测  32-33
    2.2.4 菌株的鉴定  33-34
    2.2.5 菌株发酵条件考察及抽提条件的优化实验  34-35
  2.3 结果与讨论  35-39
    2.3.1 抑菌活性检测  35
    2.3.2 SIPI 3.0070菌株鉴定  35-37
    2.3.3 SIPI 3.0070发酵条件考察及抽提条件的优化实验  37-39
  2.4 本章小结  39-41
第3章 ECB酰胺侧链水解酶基因工程菌的克隆及构建  41-63
  3.1 材料与仪器  41-44
    3.1.1 质粒  41-42
    3.1.2 菌种  42
    3.1.3 培养基  42-43
    3.1.4 主要溶液和缓冲液  43-44
    3.1.5 培养基成分  44
    3.1.6 主要仪器设备  44
  3.2 实验方法  44-49
    3.2.1 菌种的培养和保藏  44-45
    3.2.2 链霉菌总DNA的提取  45
    3.2.3 大肠杆菌感受态的制备  45-46
    3.2.4 大肠杆菌质粒转化  46
    3.2.5 大肠杆菌质粒的抽提  46
    3.2.6 PCR反应体系  46-47
    3.2.7 DNA片段的回收(B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收)  47
    3.2.8 核酸片段的脱磷反应与回收  47
    3.2.9 酰胺水解酶阳性菌株的构建与筛选  47-48
    3.2.10 工程菌对于ECB底物的转化  48
    3.2.11 ECB侧链水解转化率的测定  48-49
  3.3 结果与讨论  49-62
    3.3.1 含有酰胺水解酶及上下游基因的质粒构建  49-54
    3.3.2 含有ECB酰胺水解酶基因及红霉素启动子质粒的构建  54-60
    3.3.3 ECB侧链水解转化率的测定  60-62
  3.4 本章小结  62-63
全文总结  63-65
攻读学位期间发表的学术论文  65-66
参考文献  66-69
致谢  69-70
附录  70-82

植物内生真菌来源抗菌物质的筛选及产ECB侧链酰胺水解酶基因工程菌的构建

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