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去氢表雄酮的生物法羟基化修饰研究

作　者: 刘佩卉
导　师: 刘新利
学　校: 山东轻工业学院
专　业: 发酵工程
关键词: 去氢表雄酮微生物转化斜卧青霉 1α-羟基去氢表雄酮
分类号: TQ463.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

1α-羟基去氢表雄酮(1α-hydroxy dehydroepiandrosterone )是用于合成活性维生素D3及其类似物的一个重要的中间体。活性维生素D3作用于多种靶组织,生理作用也多种多样,广泛用于治疗骨质疏松、甲状旁腺亢进(肾衰)、牛皮癣、癌症以及免疫疾病等。在由去氢表雄酮半化学合成活性维生素D3类药物的过程中,去氢表雄酮(dehydroepiandrosterone, DHEA)的1α-羟基化是首要步骤,也是最关键的步骤之一。本文采用微生物转化的方法对去氢表雄酮进行1α-羟基化修饰。首先采用富集培养技术和梯度底物浓度定向筛选技术从土壤中筛选出能转化去氢表雄酮为1α-羟基去氢表雄酮的菌株。通过形态学及分子生物学手段对该菌株进行了鉴定,确定该菌为青霉属的斜卧青霉。对转化产物的结构进行确认,证实了转化产物为1α-羟基化去氢表雄酮。通过紫外诱变等手段对筛选出的菌株进行诱变处理,通过3轮紫外诱变得到了一株转化率较高且遗传较稳定的菌株。对ph-13的发酵和转化条件的进行了研究,结果表明种子培养基的最适碳氮源分别为葡萄糖、酵母浸粉;转化培养基的最佳碳氮源分别为蔗糖和硝酸钠。孢子粉接到种子培养基中的最佳浓度为5×10~7个/mL。对ph-13转化去氢表雄酮1α-羟基化工艺优化后,得到了最佳转化培养基配方:蔗糖为4.75 g/L,硝酸钠为3.69 g/L,硫酸镁为0.3 g/L,硫酸锰为0.0001 g/L,硫酸亚铁为0.0001 g/L。在优化后的培养基中目标产物1α-羟基去氢表雄酮转化率达到18.83%。最后,研究了1α-羟基化去氢表雄酮的分离纯化方法。转化结束后,抽滤,固液分离,用二氯甲烷对菌体和发酵液进行萃取。用硅胶层析、LH-20凝胶层析、PTLC、结晶/重结晶等手段对二氯甲烷萃取物进行分离,得到了白色的针状1α-羟基化去氢表雄酮,同时得到另一种白的粉末状转化产物,经鉴定为7α-羟基去氢表雄酮。

全文目录

摘要  9-10
ABSTRACT  10-11
第1章绪论  11-25
  1.1 甾体药物简介  11-12
  1.2 甾体药物的化学修饰和生物修饰  12-16
    1.2.1 甾体药物的主要修饰反应类型  12-14
    1.2.2 甾体药物的生物修饰  14
    1.2.3 甾体化合物微生物转化研究发展史  14-15
    1.2.4 应用于甾体药物羟基化反应的相关技术  15-16
  1.3 活性维生素D3 类甾体药物及其修饰合成  16-20
    1.3.1 活性维生素D3 类药物  16-17
    1.3.2 活性维生素D3 的合成  17-19
    1.3.3 活性维生素D3 受体  19-20
  1.4 去氢表雄酮及其药物中间体的应用  20-23
    1.4.1 去氢表雄酮的结构及其在体内的代谢  20
    1.4.2 去氢表雄酮的生理活性  20-22
    1.4.3 去氢表雄酮的药物中间体作用  22-23
  1.5 课题的研究意义及研究内容  23-25
    1.5.1 课题的研究意义  23-24
    1.5.2 课题的主要研究内容  24-25
第2章菌种的筛选、鉴定及转化产物的特性研究  25-41
  2.1 前言  25
  2.2 材料与方法  25-30
    2.2.1 材料  25-27
    2.2.2 实验方法  27-30
      2.2.2.1 菌种筛选  27-28
      2.2.2.2 形态学鉴定  28
      2.2.2.3 分子生物学鉴定  28-29
      2.2.2.4 转化产物的制备  29
      2.2.2.5 转化产物的结构分析  29-30
  2.3 实验结果  30-39
    2.3.1 转化菌株的筛选  30-32
    2.3.2 菌株形态学鉴定  32
    2.3.3 菌株分子生物学鉴定  32-36
    2.3.4 转化产物的结构鉴定  36-39
      2.3.4.1 产物的全波段光谱扫描曲线  36
      2.3.4.2 转化产物的HPLC 分析  36-37
      2.3.4.3 转化产物的核磁数据分析  37-39
  2.5 小结  39-41
第3章 Penicillium decumbens ph-13 菌株的诱变  41-49
  3.1 前言  41
  3.2 材料与方法  41-44
    3.2.1 材料  41
      3.2.1.1 菌种  41
      3.2.1.2 培养基  41
      3.2.1.3 仪器及试剂  41
    3.2.2 实验方法  41-44
      3.2.2.1 转化的方法  41
      3.2.2.2 样品处理的方法  41-42
      3.2.2.3 转化产物的检测方法  42
      3.2.2.4 诱变方法  42-44
  3.3 实验结果  44-47
    3.3.1 TLC 展开剂的选择  44-45
    3.3.2 产物1α-hydroxyDHEA 标准曲线的绘制  45-46
    3.3.3 紫外线诱变剂量的确定  46
    3.3.4 优良性状突变株的筛选  46-47
    3.3.5 诱变菌株稳定性的研究  47
  3.4 小结  47-49
第4章发酵和转化条件的研究  49-71
  4.1 前言  49
  4.2 材料与方法  49-50
    4.2.1 材料  49
      4.2.1.1 菌种  49
    4.2.2 实验方法  49-50
      4.2.2.1 孢子的保藏与扩增  49
      4.2.2.2 孢子悬浮液的配制  49
      4.2.2.3 去氢表雄酮的微生物转化  49-50
      4.2.2.4 1α-羟基化去氢表雄酮的提取  50
      4.2.2.5 去氢表雄酮转化率的测定  50
      4.2.2.6 菌体生物量的测定  50
      4.2.2.7 菌体生长曲线测定  50
  4.3 实验结果  50-69
    4.3.1 种子培养基中孢子浓度的确定  50
    4.3.2 种子培养基营养成分对菌体生物量、菌体形态及转化率的影响  50-54
    4.3.3 种子培养条件对菌体生长及转化率的影响  54-55
    4.3.4 菌体的生长曲线  55-56
    4.3.5 转化培养基的对转化率的影响  56-62
    4.3.6 转化条件的优化  62-69
  4.4 小结  69-71
第5章转化产物的分离纯化及其特性的研究  71-81
  5.1 前言  71
  5.2 材料和方法  71-74
    5.2.1 材料  71-72
      5.2.1.1 菌种  71
      5.2.1.2 培养基  71
      5.2.1.3 试剂  71
      5.2.1.4 仪器设备  71-72
    5.2.2 实验方法  72-74
      5.2.2.1 转化产物的检测  72
      5.2.2.2 DHEA 转化产物大量制备  72-73
      5.2.2.3 转化产物提取的优化  73
      5.2.2.4 目的产物的分离与纯化(硅胶柱层析法)  73-74
      5.2.2.5 凝胶柱层析法  74
  5.3 实验结果  74-80
    5.3.1 提取条件对提取收率的影响  74-76
    5.3.2 转化产物的粗提  76-77
    5.3.3 转化产物的分离纯化  77-78
    5.3.4 化合物的结构解析  78-80
      5.3.4.1 化合物a  78-79
      5.3.4.2 化合物b  79-80
  5.4 小结  80-81
第6章全文总结与展望  81-83
  6.1 总结  81
  6.2 展望  81-83
参考文献  83-89
致谢  89-91
在学期间主要科研成果  91
  一、发表学术论文  91
  二、其它科研成果  91

去氢表雄酮的生物法羟基化修饰研究

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