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红豆杉内生真菌遗传多样性分析及生物转化研究

作　者: 任娜
导　师: 杨栋梁；刘佳佳
学　校: 中南大学
专　业: 制药工程
关键词: 内生真菌红豆杉 SRAP 微生物转化
分类号: S791.49
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

红豆杉又称紫杉、赤柏松,为红豆杉科红豆杉属植物,属珍稀植物濒危物种,有“活化石植物”之称。内生真菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活在植物的各种组织,对植物组织不会引起病害症状的真菌,已被作为活性次生代谢产物的重要来源。目前,红豆杉内生真菌的研究已成为医药领域的一个热点。本试验首先利用传统的形态学鉴定方法对20株来自南方红豆杉(Taxus chinensis)和云南红豆杉(Taxus yunnanensis)的供试菌株进行形态学鉴定,结果显示：20株供试菌株被分为4类,分别为曲霉属,黑孢霉属,青霉属,木霉属。再选取7株代表内生真菌,以紫杉醇标准品作对照品,结合TLC、UV和HPLC技术,进一步研究内生真菌代谢产物的相关性,结果显示,EFTⅤ-01、EFTⅠ-03具有分泌紫杉醇或紫杉醇类似物的能力。研究发现同一种属的不同菌株间的代谢产物具有一定相关性。为了筛选出更优良的紫杉醇产生菌,本文采用相关序列扩增多态性(SRAP)分子标记技术对20株红豆杉内生真菌菌株进行遗传多样性分析。结果显示：24对srap引物共扩增出584条带,其中多态性条带446条,多态性比率为76.4%,分子量范围为100bp～2000bp,在以相似系数0.601为阈值时,SRAP标记可将20株菌株分为4类,在以相似系数0.921为阈值时可将20株菌株进一步分为9类。研究表明红豆杉内生真菌具有丰富的遗传多样性,SRAP能较好地应用于红豆杉内生真菌种间和种内的遗传多样性分析,为产紫杉醇红豆杉内生真菌的进一步研究提供了依据。本文结合超高效液相色谱(UPLC)和GC-MS技术,调查红豆杉内生真菌对葡萄干提取物和艾叶油的生物转化,以期获得更多萜类化合物。结果显示：以葡萄干醇提物为转化底物,目标菌株EFTV-01可能产新化合物：2,2-二甲基辛醇、2,4-二异丙基-1,1-二甲基-环己烷、甾体化合物；以艾叶油为转化底物,目标菌株EFTV-01能转化生产新的萜类化合物：丁醚脲、δ-榄香烯、δ-杜松烯和β-法呢烯。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
第一章文献综述  10-21
  1.1 植物内生真菌概述  10-17
    1.1.1 植物内生真菌定义  10
    1.1.2 植物内生真菌物种多样性  10-11
    1.1.3 植物内生真菌代谢产物多样性  11-14
    1.1.4 植物内生真菌的研究方法  14-15
    1.1.5 SRAP分子标记在遗传多样性研究的应用  15-17
  1.2 红豆杉概述  17
  1.3 红豆杉内生真菌研究进展  17-19
    1.3.1 国外红豆杉内生真菌研究概况  17-18
    1.3.2 国内红豆杉内生真菌研究概况  18-19
  1.4 微生物转化概述  19-20
    1.4.1 概念  19-20
    1.4.2 微生物转化的应用  20
  1.5 本研究的目的及意义  20-21
第二章红豆杉内生真菌形态学鉴定及代谢产物相关性分析  21-33
  2.1 材料与方法  21-23
    2.1.1 菌株  21
    2.1.2 试验用培养基  21-22
    2.1.3 实验用试剂  22
    2.1.4 实验用仪器  22-23
  2.2 红豆杉内生真菌形态学鉴定  23
    2.2.1 菌株活化  23
    2.2.2 内生真菌形态学鉴定  23
  2.3 内生真菌代谢产物相关性分析  23-25
    2.3.1 代谢产物的分离及检测  23-24
    2.3.2 薄层色谱(TLC)分析  24-25
    2.3.3 紫外光谱(UV)分析  25
    2.3.4 高效液相色谱(HPLC)分析  25
    2.3.5 GC-MS分析  25
  2.4 结果  25-31
    2.4.1 菌株的形态学鉴定结果  25-27
    2.4.2 TLC分析结果  27
    2.4.3 HPLC分析结果  27-29
    2.4.4 GC-MS结果  29-31
  2.5 讨论  31-32
  2.6 本章小结  32-33
第三章红豆杉内生真菌遗传多样性分析  33-44
  3.1 材料与方法  33-37
    3.1.1 实验仪器  33
    3.1.2 试剂  33-34
    3.1.3 供试样品  34-35
    3.1.4 培养基  35
    3.1.5 菌丝制备  35
    3.1.6 DNA提取  35
    3.1.7 SRAP引物  35-36
    3.1.8 SRAP的PCR扩增  36
    3.1.9 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染  36-37
    3.1.10 数据统计和分析  37
  3.2 红豆杉内生真菌间遗传多样性结果与分析  37-40
    3.2.1 SRAP-PCR扩增结果  37-39
    3.2.2 遗传分析  39
    3.2.3 聚类分析结果  39-40
  3.3 红豆杉内生真菌与宿主植物间的遗传关系  40-42
    3.3.1 SRAP-PCR扩增结果  40-41
    3.3.2 聚类分析结果  41-42
  3.4 讨论  42-43
  3.5 本章小结  43-44
第四章红豆杉内生真菌生物转化研究  44-57
  4.1 材料和仪器  44-46
    4.1.1 菌种  44
    4.1.2 试剂  44-45
    4.1.3 仪器  45
    4.1.4 培养基  45
    4.1.5 超高效液相检测  45
    4.1.6 GC-MS分析  45-46
  4.2 红豆杉内生真菌的生物转化  46-47
    4.2.1 葡萄干有效成分提取方法  46
    4.2.2 红豆杉内生真菌对葡萄干提取物的生物转化  46
    4.2.3 红豆杉内生真菌对艾叶油的生物转化  46-47
  4.3 结果与讨论  47-56
    4.3.1 葡萄干提取物转化前后的超高效液相结果  47-50
    4.3.2 葡萄干提取物转化前后的GC-MS分析结果  50-53
    4.3.3 艾叶油转化前后的GC-MS分析结果  53-56
  4.4 本章小结  56-57
第五章总结  57-59
参考文献  59-66
致谢  66

红豆杉内生真菌遗传多样性分析及生物转化研究

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