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脂肪酶催化猪油合成Vc脂肪酸酯及其抗氧化活性的研究

作　者: 刘建伟
导　师: 陆兆新
学　校: 南京农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 猪油酶法合成 Vc脂肪酸酯填充床反应器分离纯化抗氧化活性
分类号: TS202.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

Vc脂肪酸酯既含有亲水性的L-抗坏血酸,又含有亲油性的脂肪酸链,使得其兼具脂溶性抗氧化剂和食品乳化剂的特性,是一种新型的多功能食品添加剂。本文以廉价的猪油和L-抗坏血酸为原料,微生物来源的脂肪酶作为催化剂,在有机相中酶催化合成Vc脂肪酸酯,开发出一种营养型抗氧化剂,为绿色食品添加剂的开发提供理论依据。主要研究结果如下：(1)酶催化法合成Vc脂肪酸酯工艺条件的研究。研究了Novozyme 435、Lipozyme TL IM、Lipozyme RM IM、洋葱假单胞菌S31脂肪酶等4种脂肪酶的催化性能,筛选出合成Vc脂肪酸酯效果好Novozyme 435。研究了加酶量、反应介质、反应温度、底物摩尔比、分子筛用量和分子筛加入时间对反应的影响。确定了最佳反应条件是：反应介质为叔戊醇,酶用量为40%(W/W,固定化酶/Vc),底物摩尔比2.5：1(猪油/Vc),反应温度55。C,4 A分子筛在反应6 h加入,添加量为15 g/L,反应时间为24 h。在此条件下,L-抗坏血酸的转化率可达到65.1%。同时酶的稳定性良好,可以进行6个批次的反应而酶活变化不大,转化率保持在50%以上。在单因素实验的基础上,选择底物摩尔比、温度、酶量、反应时间4因素进行L9(34)正交试验。确定最佳的工艺条件：底物摩尔比为3：1,温度为55℃,酶量为30%,反应时间为24 h。在此最优工艺条件下转化率达79.1%,比单因素实验结果(65.1%)提高14个百分点。(2)填充床反应器连续化合成Vc脂肪酸酯的工艺研究。初步研究了填充床酶反应器合成Vc脂肪酸酯的工艺参数。工艺参数为：55℃下,猪油浓度100mmol/L (猪油与Vc摩尔比为1.4：1),流速1.0 mL/min,添加4 A分子筛到反应体系中,48 h后产物浓度达到13.5 g/L,转化率为42.5%。在此基础上,采用响应曲面分析法(RSM)对影响填充床式反应器中酯交换反应的主要因子即流速、温度、底物摩尔比进行优化。结果表明,在流速为1.07 mL/min,温度为56.44℃,猪油与Vc摩尔比率为2.24的条件下,转化率可达50.83%。验证试验结果表明,Vc脂肪酸酯的转化率为50.5±1.3%,与理论预测值吻合,证明这一模型在因子水平范围内是有效的。固定化酶在使用3批时,转化率仍保持在50%以上。(3)Vc脂肪酸酯分离纯化工艺的研究。确定粗产品与正己烷的用量比为1：6,洗涤温度控制在40-50℃,产品Vc脂肪酸酯回收率在55%左右；洗涤Vc时,所用乙酸乙酯和水的最佳体积比为1：4；产品的重结晶温度为15℃,用溶剂正己烷与无水乙醇的体积比为1：0.5时,产品的结晶速度、结晶形态较好,回收率达到70%,纯度为96%以上。(4)Vc脂肪酸酯的抗氧化活性研究。在得到产物纯品的基础上,对产品进行了ESI-MS分析,进一步确定了分离纯化所得到白色固体由Vc豆蔻酸酯、Vc月桂酸酯、Vc棕榈一烯酸酯、Vc棕榈酸酯、Vc油酸酯、Vc硬脂酸酯组成,分别占1.81%、0.75%、2.66%、46.45%、14.29%、34.04%。从羟基自由基体系、超氧阴离子自由基体系、二苯苦味肼基自由基体系及还原力测试等方面研究Vc脂肪酸酯体外抗氧化活性,并将其添加到猪油和大豆油当中,评价其抗氧化效果。结果表明,在一定的浓度范围内,Vc脂肪酸酯对HO·、O2-·、DPPH·自由基均有较好的清除效果,还原能力也较强,并呈一定量效关系,其抗氧化活性与AP相当。Vc脂肪酸酯在猪油中的添加量为0.2%,100℃下强制氧化20 h时,猪油的POV值为42.8 meq/kg,具有明显的抗氧化活性；在大豆油中添加0.2%,强制氧化14h时,大豆油的POV值为11.9 meq/kg,其抗氧化能力大于TBHQ,与AP接近,说明Vc脂肪酸酯是一种有潜力的食品抗氧化剂。

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摘要 7-9ABSTRACT 9-12图形索引 12-15表格索引 15-16第一章文献综述 16-29 1 前言 16 2 Vc脂肪酸酯简介 16-18 3 非水相酶催化技术 18-23 3.1 非水相酶催化的介质系统 19-22 3.1.1 有机相体系 19-20 3.1.2 反胶束体系 20 3.1.3 超临界流体体系 20-21 3.1.4 无溶剂或少溶剂反应体系 21 3.1.5 离子液体 21-22 3.2 非水相体系中微量水对酶催化性能的影响 22-23 4 酶促法合成Vc脂肪酸酯的研究展望 23 5 本论文研究内容、目的及其意义 23-25 参考文献 25-29第二章酶法合成Vc脂肪酸酯工艺条件的研究 29-44 1 材料与方法 29-31 1.1 材料 29 1.2 Vc脂肪酸酯的合成 29-30 1.3 Vc脂肪酸酯的HPLC分析 30 1.4 Vc脂肪酸酯的标准曲线 30-31 2 结果与分析 31-40 2.1 脂肪酶的筛选 31-32 2.2 反应体系的影响 32-33 2.3 底物摩尔比的影响 33-34 2.4 酶量的影响 34-35 2.5 反应温度的影响 35-36 2.6 分子筛用量的影响 36 2.7 分子筛加入时间的影响 36-37 2.8 酶稳定性 37-38 2.9 正交试验 38-40 2.9.1 正交试验设计 38-39 2.9.2 验证性试验 39-40 3 讨论 40 4 本章小结 40-42 参考文献 42-44第三章 Vc脂肪酸酯的填充床反应器的工艺研究及产物分离纯化研究 44-67 1 材料及方法 45-47 1.1 材料 45 1.2 有机溶剂脱水 45 1.3 填充床酶反应器连续化合成Vc脂肪酸酯的工艺 45-46 1.4 产物含量、纯度、转化率和回收率的计算方法 46 1.5 响应曲面设计 46-47 1.6 产物的分离纯化 47 2 结果与分析 47-63 2.1 填充床反应器中酶催化Vc脂肪酸酯的合成 47-57 2.1.1 不同猪油浓度对产物浓度的影响 47-48 2.1.2 不同底物摩尔比对转化率的影响 48 2.1.3 不同滞留时间ζ对反应产物浓度的影响 48-49 2.1.4 循环反应过程中分子筛的加入对产物浓度的影响 49-50 2.1.5 循环反应时间对产物浓度的影响 50-51 2.1.6 响应曲面试验 51 2.1.7 建立模型方程与显著性检验 51-53 2.1.8 填充床反应器中酯化反应参数响应面交互作用分析与优化 53-56 2.1.9 填充床反应器中脂肪酶重复批次使用对合成Vc脂肪酸酯的影响 56-57 2.2 产物的分离纯化 57-60 2.2.1 不同有机溶剂洗涤效果 57-58 2.2.2 正己烷洗涤用量的影响 58 2.2.3 正己烷洗涤温度的影响 58-59 2.2.4 乙酸乙酯和去离子水的配比的影响 59-60 2.3 Vc脂肪酸酯的重结晶研究 60-63 2.3.1 Vc脂肪酸酯的溶解度测定 60 2.3.2 重结晶混合溶剂的最佳配比 60-61 2.3.3 重结晶温度对产品回收率的影响 61 2.3.4 纯化后的产品HPLC分析 61-62 2.3.5 Vc脂肪酸酯生产工艺流程图 62-63 3 讨论 63 4 本章小结 63-65 参考文献 65-67第四章 Vc脂肪酸酯的抗氧化活性研究 67-84 1 材料与方法 67-69 1.1 材料 67 1.2 Vc脂肪酸酯的TLC分析 67-68 1.3 Vc脂肪酸酯的HPLC-ESI-MS分析 68 1.4 Vc脂肪酸酯对羟自由基清除能力的测定 68 1.5 Vc脂肪酸酯对超氧阴离子自由基清除能力的测定 68-69 1.6 Vc脂肪酸酯对DPPH自由基清除能力的测定 69 1.7 Vc脂肪酸酯的还原能力 69 1.8 Vc脂肪酸酯的抗氧化性能测定 69 2 结果与分析 69-79 2.1 产物性状及结构鉴定 69-70 2.2 产物的TLC分析 70 2.3 产物HPLC-ESI-MS分析 70-74 2.4 Vc脂肪酸酯清除羟自由基能力 74-75 2.5 Vc脂肪酸酯清除超氧阴离子自由基能力 75-76 2.6 Vc脂肪酸酯清除DPPH自由基清除能力 76-77 2.7 Vc脂肪酸酯的还原能力 77-78 2.8 Vc脂肪酸酯的抗氧化性能测定 78-79 3 讨论 79-80 4 本章小结 80-81 参考文献 81-84全文结论 84-86论文创新点 86-88致谢 88-90攻读硕士期间发表及投稿论文情况 90

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