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化学酶法合成LNT系列人乳寡糖

作　者: 尹晓娟
导　师: 姬胜利; 曹鸿志
学　校: 山东大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 人乳寡糖化学酶法合成乳-N-四糖 GalK BiGalHexNAcP
分类号: R914
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

人乳寡糖是存在于人乳中的一类天然存在的低聚糖：对婴儿消化系统的早期发育,及出生后免疫系统的完善和体内生态平衡的建立发挥着不可替代的作用。另有研究表明某些人乳寡糖由于与一些病原菌识别的人体糖链结构相似,可以通过竞争性抑制病原体与其配体的特异性结合进而保护婴幼儿免受这些病原体的感染。而乳-N-三糖和乳-N-四糖(LNT)及其岩藻糖化和唾液酸化衍生物是构成人乳寡糖的重要组分,其中乳-N-三糖(GlcNAc β1-3Gal β1-4Glc)和乳-N-四糖(Gal β1-3GlcNAc β1-3Gal β1-4Glc)更是人乳寡糖的核心结构,人乳寡糖的绝大部分组分都是在此基础上进行唾液酸化和/或岩藻糖基化衍生来的。虽然近年来对人乳寡糖各组分的研究不断深入,但其具体的生物功能还不是很明确,因此获得足够量结构均一的人乳寡糖单体来开展它们的生物学功能研究以及开发其在医药领域的应用是现阶段研究人员迫切需要解决的问题。众所周知,化学合成是获得结构确定寡糖的可靠方法,近年来陆续出现了一些关于乳-N-四糖化学合成的报道,但其步骤繁多,操作条件要求严格,并且总收率很低,难以达到大量合成并用于其生物学功能研究的目的。为得到大量的乳-N-三糖和乳-N-四糖,简化反应步骤,提高总收率,我们考虑充分结合化学合成和酶法合成的优点,运用化学酶法合成策略来合成LNT系列人乳寡糖。本论文的研究工作主要包括以下两个方面：首先,我们用化学方法合成人乳寡糖的一个重要组成成分一乳-N-三糖。然后,以这一三糖作为受体,通过对半乳糖磷酸激酶(GalK)和一种糖苷酶(BiGalHexNAcP)两种酶的灵活运用,在一锅双酶反应体系中将一分子半乳糖引入到乳-N-三糖受体上,合成了LNT。本论文以N-葡萄糖胺盐酸盐、乳糖为起始原料,通过对乳糖的全乙酰化、异头位选择性脱保护,化学糖苷化等合成了含有末端叠氮基团连接体的乳糖衍生物。选择性裸露所得到的乳糖衍生物的3’,4’位羟基,与活化的葡萄糖胺给体进行选择性化学糖苷化,再经保护基操作等完成了人乳寡糖的重要组成部分乳-N-三糖的合成。乳-N-三糖的化学合成所采用的反应条件较为温和,试剂价廉易得,某些中间体甚至不需要进行柱层析分离就可直接进行下一步反应,真正达到了高效且易于大量合成的目标。第二部分通过半乳糖磷酸激酶(GalK)和一种糖苷酶(BiGalHexNAcP)的双酶联用可一步将半乳糖引入到三糖受体的非还原末端上,从而完成了人乳寡糖核心结构乳-N-四糖的合成。总之,我们应用化学酶法合成策略,成功合成了人乳寡糖的核心结构乳-N-三糖及乳-N-四糖。由于现今唾液酸转移酶和岩藻糖转移酶研究均较为成熟,乳-N-三糖和四糖的成功合成为合成人乳低聚糖系列化合物提供了重要中间体,对于合成唾液酸化和/或岩藻糖化的乳寡糖和深入研究人乳寡糖的生物活性具有重要的意义。

全文目录

中文摘要  10-13
Abstract  13-15
Abbreviations  15-17
第一章前言  17-41
  1 HMOs简介  17-41
    1.1 HMOs结构  18-22
    1.2 HMOs生物学功能  22-26
      1.2.1 抵御病原菌感染  22-24
      1.2.2 维护肠道微生态平衡  24-25
      1.2.3 调节免疫  25
      1.2.4 预防炎症性大肠疾病和胃肠炎  25
      1.2.5 预防癌症  25-26
      1.2.6 其他生物功能  26
    1.3 寡糖合成的研究现状  26-34
      1.3.1 寡糖的化学合成  26-31
      1.3.2 酶法合成  31-33
      1.3.3 小结  33-34
    1.4 现有的人乳寡糖LNT衍生物的合成途径  34-40
      1.4.1 合成途径一  34-36
      1.4.2 合成途径二  36-37
      1.4.3 合成途径三  37-38
      1.4.4 合成途径四  38-39
      1.4.5 小结  39-40
    1.5 本课题立题依据  40-41
第二章本实验合成途径的设计  41-43
第三章化学实验部分  43-60
  3.1 实验仪器  43-44
  3.2 实验试剂  44-46
    3.2.1 普通试剂  44-45
    3.2.2 无水试剂的预处理  45-46
  3.3 实验路线设计  46-60
    3.3.1 合成单糖模块  46-48
    3.3.2 合成乳糖受体模块  48-60
第四章酶合成部分  60-74
  4.1 实验仪器  60-61
  4.2 实验试剂  61-62
  4.3 酶的表达纯化  62-72
    4.3.1 GalK的表达纯化  62-67
    4.3.2 BiGalHexNAcP的表达纯化  67-72
  4.4 目标化合物的酶法合成  72-74
第五章总结与展望  74-75
  5.1 总结  74
  5.2 展望  74-75
附录  75-84
参考文献  84-90
致谢  90-91
攻读硕士学位期间发表的学术论文  91-92
学位论文评阅及答辩情况表  92

化学酶法合成LNT系列人乳寡糖

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