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鸡新城疫病毒诱导鸡胚成纤维细胞凋亡的研究

作　者: 冉旭华
导　师: 崔玉东
学　校: 黑龙江八一农垦大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 新城疫病毒鸡胚成纤维细胞细胞凋亡 Caspases途径
分类号: S852.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的鸡急性、高度传染性疾病。NDV是副粘病毒科(Papramyxoviridae)腮腺炎病毒属(Rubulavirus)成员。病毒核酸为单股、负链、不分节段的RNA。NDV能在鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblasts, CEF)上生长,并产生细胞病变(cytopathiceffect, CPE)。近年来的研究发现NDV感染后,除了导致组织损伤、细胞病变、细胞融合外,还能诱导宿主细胞凋亡。已经证实NDV感染后能通过干扰素和TNF途径诱导细胞凋亡,但能否通过Caspases途径诱导感染细胞凋亡尚未见报道。本研究应用不同的Caspases抑制剂Z-VAD.fmk、Z-DEVD.fmk、Z-IETD.fmk、Z-LEHD.fmk、Z-AEVD.fmk研究了参与NDV-Mukteswar株诱导CEF凋亡的Caspases,确定了NDV可以通过Caspases依赖性途径诱导CEF凋亡。同时还研究了NDV弱毒株Clone-30诱导CEF凋亡的情况。为进一步了解NDV的致病机制,将来在临床上更好地预防和治疗ND提供理论参考。为确定NDV中等毒力毒株Mukteswar诱导CEF凋亡,首先将病毒以500 TCID50的浓度感染CEF,72h后进行形态学检查和DNA片段化分析。结果NDV感染使细胞之间的连接消失,染色质浓缩断裂,细胞膜内陷,凋亡小体(apoptotic body)形成,基因组DNA断裂成188bp左右及成其整数倍的片段、琼脂糖凝胶电泳呈现典型的凋亡带,即DNA梯形电泳带(ladder)。这表明NDV能够诱导CEF凋亡。为确定病毒诱导细胞凋亡的有效浓度及细胞凋亡的时间进程,将Mukteswar株以500 TCID50的浓度感染细胞,分别提取感染后12、24、36、48、60、72 h的细胞基因组DNA,进行DNA片段化检测分析,结果在感染后48 h,DNA琼脂糖凝胶电泳出现明显的梯形电泳带。尔后,将病毒分别以100、150、200、250、300、400 TCID50的浓度感染细胞,培养48 h后进行DNA片段化检测分析,结果确定该病毒以200TCID50浓度接种为宜。以上结果表明,以200 TCID50的病毒浓度感染CEF、在感染后48 h时检测凋亡细胞的基因组DNA片段化为佳。Caspases的活化是细胞凋亡的关键。为了解在NDV诱导CEF凋亡的过程中是否有Caspases参与,在NDV-Mukteswar接种CEF前2 h用Caspases抑制剂Z-VAD处理细胞,接种病毒后进行形态学检查与DNA片段化检测分析,结果Z-VAD fmk对凋亡有明显的抑制作用,这表明NDV通过Caspases途径诱导细胞凋亡。在试验中还发现在使用抑制剂时虽然抑制了凋亡的发生,但病毒仍引起细胞病变,而且病

全文目录

中文摘要  5-7
引言  7-10
文献综述:病毒感染与细胞凋亡  10-23
  1细胞凋亡概述  10-12
  2病毒编码的产物诱导宿主细胞凋亡  12-15
  3病毒编码产物抑制细胞凋亡  15-20
  4潜在的病毒调节宿主细胞凋亡的途径  20-21
  5结语  21-23
材料与方法  23-30
  1材料  23-26
  2试验方法  26-30
试验结果  30-39
  1 NDV-Mukteswar株诱导CEF凋亡  30
  2 NDV-Mukteswar株诱导CEF凋亡的浓度及时间进程  30-33
  3 NDV-Mukteswar株通过Caspases途径诱导CEF凋亡  33-34
  4 DNA片段化分析检测Z-DEVD.fmk、Z-IETD.fmk、Z-LEHD.fmk、Z-AEVD.fmk对NDV诱导的CEF凋亡的影响  34
  5 NDV弱毒株Clone 30不能诱导CEF凋亡  34-39
分析与讨论  39-42
结论  42-43
参考文献  43-50
致谢  50-51
英文摘要  51-53
附录  53-54

鸡新城疫病毒诱导鸡胚成纤维细胞凋亡的研究

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