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L-丝氨酸产生菌的选育及发酵条件优化

作　者: 卢发
导　师: 张伟国
学　校: 江南大学
专　业: 生物化工
关键词: L-丝氨酸甘氨酸诱变育种发酵条件优化
分类号: TQ922.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

尽管L-丝氨酸(L-Serine)属于非必需氨基酸,但由于它在生物体内具有许多重要的生理功能,并可作为多种有用化合物的前体,因此,它在化工、制药、化妆品及食品等工业及科学研究中有着广泛的用途。本论文涉及野生型L-丝氨酸产生菌的筛选、菌株的遗传育种及摇瓶发酵条件的优化等研究内容。主要研究内容和结果如下:(1)采用纸层析法对发酵液中L-丝氨酸进行了定性、定量分析,绘制出了L-丝氨酸的标准曲线,并推导出了通过测定吸光度来计算发酵液中L-丝氨酸和甘氨酸含量的计算公式。研究发现该法具有较高的准确度和精密度,并且操作方便、易于掌握,非常适合在L-丝氨酸产生菌筛选中应用。(2)从自然界中筛选得到一株野生型L-丝氨酸产生菌A3,它能把20g/L的甘氨酸转化为1.40g/L L-丝氨酸。并对该菌株生理生化特征进行了较为详细的研究,对照伯杰氏细菌学鉴定手册,初步鉴定该菌株为微球菌属。(3)以野生型L-丝氨酸产生菌—微球菌A3为出发菌株,采用DES和紫外诱变,分别以磺胺胍(SG)、甘氨酸、乙硫氨酸(Eth)三种物质为药物抗性,最后筛选获得了一株L-丝氨酸产生菌S63-31 (SGrGlyrEthr),在未经优化的条件下,L-丝氨酸发酵产量为6.5g/L。(4)对L-丝氨酸产生菌S63-31的发酵条件进行了优化研究,确定了最佳种子培养基组成为(g/L):葡萄糖20,玉米浆25,(NH4)2SO4 10,KH2PO4 1,MgSO4·7 H2O 0.2,CaCO3 20,pH7.0~7.2。最佳种子培养条件:装液量为40mL/250mL圆底三角瓶,摇瓶转速为100次/min,培养温度为31℃,种龄为10h,接种量为8%。最佳发酵培养基组成为(g/L):甘氨酸20,(NH4)2SO4 15,KH2PO4 2, MgSO4·7 H2O 0.4,玉米浆15,CaCO3 20,pH 8.0。并发现添加适量的丙二酸、苏氨酸和低浓度的SDS有利于L-丝氨酸的积累。最佳摇瓶培养条件:装液量为15mL/250mL圆底三角瓶,摇瓶转速为100次/min,振幅90mm,培养温度为31℃,发酵周期为72h。菌株S63-31在优化条件下的L-丝氨酸产量(7.36g/L)比初始条件下(6.5g/L)提高了13.23% ,L-丝氨酸对甘氨酸的摩尔转化率为26.27%。

全文目录

中文摘要  6-7
英文摘要  7-8
第一章绪论  8-18
  1.1 引言  8
  1.2 L-丝氨酸的理化性质  8
  1.3 L-丝氨酸的用途  8
  1.4 L-丝氨酸的生产方法  8-10
    1.4.1 提取法  8-9
    1.4.2 化学合成法  9-10
    1.4.3 发酵法生产 L-丝氨酸  10
    1.4.4 酶法生产 L-丝氨酸  10
  1.5 发酵法生产 L-丝氨酸的研究实例  10-16
    1.5.1 直接发酵法生产 L-丝氨酸  10
    1.5.2 前体发酵法生产 L-丝氨酸  10-16
  1.6 国内外 L-丝氨酸的生产概况  16-17
  1.7 本论文研究意义及主要研究内容  17-18
第二章发酵液中 L-丝氨酸和甘氨酸测定的研究  18-24
  2.1 引言  18
  2.2 材料与方法  18-20
    2.2.1 主要材料  18
    2.2.2 主要试剂配制  18-19
    2.2.3 方法  19-20
      2.2.3.1 定性测定 L-丝氨酸的主要步骤  19
      2.2.3.2 定量测定发酵液中 L-丝氨酸和甘氨酸的含量  19-20
      2.2.3.3 相对标准偏差  20
  2.3 结果与分析  20-23
    2.3.1 层析溶剂的选择  20-21
    2.3.2 洗脱液最佳吸收波长的测定  21
    2.3.3 最佳洗脱时间的测定  21
    2.3.4 L-丝氨酸(或甘氨酸)标准曲线的测定  21-22
    2.3.5 精密度试验  22
    2.3.6 回收率试验  22-23
  2.4 讨论  23
  2.5 本章小结  23-24
第三章 L-丝氨酸产生菌的筛选与鉴定  24-32
  3.1 引言  24
  3.2 材料  24-26
    3.2.1 主要试剂  24-25
    3.2.2 主要仪器设备  25
    3.2.3 培养基  25-26
  3.3 方法  26-28
    3.3.1 菌株筛选  26-27
      3.3.1.1 样品采集  26
      3.3.1.2 样品处理  26-27
      3.3.1.3 L-丝氨酸产生菌的筛选  27
    3.3.2 菌株鉴定  27-28
      3.3.2.1 菌落形态鉴定  27
      3.3.2.2 细胞形态鉴定  27
      3.3.2.3 菌种生理生化试验  27-28
      3.3.2.4 对碳源和氮源的利用情况  28
    3.3.3 分析方法  28
      3.3.3.1 pH 测定  28
      3.3.3.2 L-丝氨酸的测定  28
      3.3.3.3 菌体生长测定  28
  3.4 结果和讨论  28-31
    3.4.1 结果  28-29
      3.4.1.1 L-丝氨酸产生菌的分离与筛选  28
      3.4.1.2 菌株 A3 的培养特征  28-29
      3.4.1.3 菌株 A3 的细胞形态  29
      3.4.1.4 菌株 A3 的生理生化特征  29
      3.4.1.5 碳源和氮源同化结果  29
    3.4.2 讨论  29-31
  3.5 本章小结  31-32
第四章 L-丝氨酸产生菌的诱变育种  32-41
  4.1 引言  32
  4.2 材料与方法  32-35
    4.2.1 出发菌种  32
    4.2.2 培养基  32-33
    4.2.3 主要试剂与仪器  33
    4.2.4 培养方法  33
      4.2.4.1 种子培养  33
      4.2.4.2 发酵培养  33
    4.2.5 诱变方法  33-34
      4.2.5.1 硫酸二乙酯(DES)诱变  33
      4.2.5.2 紫外诱变  33-34
    4.2.6 筛选方法  34
      4.2.6.1 平板筛选  34
      4.2.6.2 摇瓶筛选  34
    4.2.7 分析方法  34-35
  4.3 L-丝氨酸代谢途径与选育机理  35-36
    4.3.1 L-丝氨酸合成及相关代谢途径的调节机制  35
    4.3.2 L-丝氨酸的选育机理  35-36
  4.4 结果  36-40
    4.4.1 菌体生长曲线的测定  36
    4.4.2 L-丝氨酸产生菌的选育  36-39
      4.4.2.1 L-丝氨酸产生菌的选育谱系  36-37
      4.4.2.2 诱变剂量的选择  37-38
      4.4.2.3 L-丝氨酸产生菌的选育  38-39
    4.4.3 S63-31 的遗传稳定性试验  39-40
  4.5 讨论  40
  4.6 本章小结  40-41
第五章 L-丝氨酸摇瓶发酵条件的研究  41-55
  5.1 引言  41
  5.2 材料和方法  41-42
    5.2.1 菌种  41
    5.2.2 主要试剂  41
    5.2.3 主要仪器  41
    5.2.4 培养基  41-42
  5.3 结果与讨论  42-54
    5.3.1 种子培养基的优化  42-43
    5.3.2 种子培养条件的确定  43-44
      5.3.2.1 种子培养时间的确定  44
      5.3.2.2 种子培养基初始pH 的影响  44
    5.3.3 摇瓶发酵培养基的优化  44-51
      5.3.3.1 添加不同碳源对产酸的影响  44-45
      5.3.3.2 甘氨酸浓度对产酸的影响  45-46
      5.3.3.3 添加不同浓度的甲醇对产酸的影响  46
      5.3.3.4 无机氮源对产酸的影响  46-47
      5.3.3.5 硫酸铵浓度对产酸的影响  47
      5.3.3.6 有机氮源对产酸的影响  47-48
      5.3.3.7 无机离子对产酸的影响  48-49
      5.3.3.8 有机酸添加对产酸的影响  49-50
      5.3.3.9 不同氨基酸添加对产酸的影响  50-51
      5.3.3.10 表面活性剂添加对产酸的影响  51
    5.3.4 摇瓶发酵培养条件优化  51-53
    5.3.5 优化条件下摇瓶分批发酵过程曲线  53-54
  5.4 本章小结  54-55
第六章结论和展望  55-57
  6.1 主要结论  55-56
  6.2 展望  56-57
致谢  57-58
参考文献  58-61
攻读硕士学位期间发表论文清单  61

L-丝氨酸产生菌的选育及发酵条件优化

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