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S100A13基因真核表达载体的构建及生物学性状的研究

作　者: 杨靖
导　师: 文格波
学　校: 南华大学
专　业: 内科学
关键词: S100A13基因真核表达载体转染 COS-7细胞 HepG2细胞
分类号: R736.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

目的：构建以绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein，GFP)为报告基因的重组表达质粒PcDNA3.1／NT-GFP-S1OOA13，瞬时转染观察其在COS-7细胞中的表达及亚细胞定位；以瞬时转染实验为基础，转染HepG2细胞筛选获得稳定表达S100A13基因的细胞系，对比研究转染前后HepG2细胞生物学性状的变化及对抗癌药物敏感性的差异。方法：从甲状腺癌组织中提取总RNA，采用RT-PCR技术扩增S100A13基因的编码区序列，回收PCR产物连接入克隆载体(pGEM-T载体)。扩增，质粒提取，酶切并测序鉴定。设计带6个组氨酸标签的上游引物，以第一轮克隆质粒为模板，PCR扩增产物亚克隆入PcDNA3.1／NT-GFP-topo vector，并进行测序鉴定。提取测序鉴定后的真核表达载体采用脂质体介导瞬时转染COS-7细胞，荧光显微镜下观察该基因亚细胞定位，RT-PCR验证重组S100A13 mRNA的表达；以转染COS-7细胞实验参数为基础，脂质体介导稳定转染HepG2细胞，G418筛选获得稳定表达重组S100A13基因细胞系，观察该基因在HepG2细胞的定位，RT-PCR和Western-blot验证重组S100A13 mRNA和蛋白的表达。半定量RT-PCR检测稳定转染前后细胞FGF1表达量的变化；MTT法观察转染后细胞的生长曲线；加入化疗药物5-Fu处理后，流式细胞术检测转染前后细胞凋亡率的差异。结果：酶切和测序结果证实重组质粒含有S100A13编码区序列且插入方向正确，RT-PCR证实了S100A13基因在COS-7细胞中的表达，重组S100A13基因在COS-7细胞中亚细胞定位于全胞浆。 RT-PCR和Western-blot表明重组S100A13基因在HepG2细胞中稳定表达，荧光显微镜下观察绿色荧光均匀分布于整个细胞。半定量RT-PCR表明转染PcDNA3.1／NT-GFP-S100A13组FGF1表达量明显高于阴性对照组及空载体组。但

全文目录

一、中文摘要  4-6
二、英文摘要  6-8
三、主要缩略语及英文索引  8-9
四、技术路线  9-11
五、论文正文  11-44
  前言  11-14
  实验材料  14-18
  实验方法  18-28
  实验结果  28-36
  实验讨论  36-40
  实验结论  40-41
  参考文献  41-44
六、附图  44-49
七、综述  49-56
八、致谢  56

S100A13基因真核表达载体的构建及生物学性状的研究

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