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丹酚酸A调控Nrf2通路对HepG2细胞氧化损伤保护机制的研究

作　者: 黄鹂
导　师: 姚继红
学　校: 大连医科大学
专　业: 药理学
关键词: 丹酚酸A HepG2细胞 二相酶 Nrf2
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的:本研究建立HepG2细胞系的H2O2损伤模型,探讨丹酚酸A（Salvianolic acid A,SAA）的细胞保护作用与二相解毒酶NQO1、GST、HO-1的诱导及转录因子Nrf2激活之间的关系,阐明丹酚酸A抗氧化损伤的分子机制。方法:1.丹酚酸A对HepG2细胞二相酶的诱导作用HepG2细胞随机分成四组:正常对照组;低、中、高剂量丹酚酸A组（0.2μM、2μM、20μM）。药物与细胞共同孵育6小时后分别测定以下指标:采用化学分光光度法测定还原型谷胱甘肽（Reduced Glutathione,GSH）的含量。采用免疫印迹法（Western blotting）检测细胞内醌氧化还原酶（NAD（P）H: quinone oxidoreductase l,NQO1）、血红素氧合酶-1（Heme Oxygenase-1,HO-1）、谷胱甘肽巯基转移酶（Glutathione S-transferase,GST）的蛋白表达水平。2.丹酚酸A对HepG2细胞Nrf2通路的激活作用（1）HepG2细胞随机分成四组:正常对照组;低、中、高剂量丹酚酸A组（0.2μM、2μM、20μM）。药物与细胞共同孵育6小时后测定:转录因子Nrf2（NF-E2-related factor 2）及胞浆伴侣分子Keap1（Kelch-like ECH associated protein1）的蛋白表达;采用半定量RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）法测定HO-1、Nrf2的mRNA表达水平。（2）HepG2细胞随机分为四组:阴性对照组（NC）;转染Nrf2 small interfering RNA （siRNA）组;阴性对照+丹酚酸A组（20μM）和转染Nrf2 siRNA+丹酚酸A（20μM）组。转染后,丹酚酸A作用6小时提取细胞核蛋白,免疫印迹法测定Nrf2蛋白表达水平。3.丹酚酸A对H2O2损伤的HepG2细胞的保护作用研究（1）HepG2细胞随机分为五组:正常对照组;H2O2损伤组（终浓度3.5mM）;低、中、高浓度丹酚酸A组（0.2μM、2μM、20μM）。给药2小时后,损伤组和药物组加入H2O2,继续培养4小时后进行以下试验:采用MTT法测定细胞存活率;采用化学分光光度法测定细胞上清液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）含量。（2）HepG2细胞随机分为四组:正常对照组;20μM丹酚酸A组;H2O2损伤组（终浓度3.5mM）;20μM丹酚酸A+ H2O2组。采用免疫印迹法检测细胞内NQO1、HO-1、GST及Nrf2的蛋白表达;采用RT-PCR法测定HO-1与Nrf2的mRNA表达水平。结果:1.丹酚酸A与HepG2细胞共同孵育6小时后,与对照组相比,药物组GSH活性提高（P<0.01）,在中、高剂量组尤为明显,呈剂量依赖性。2.丹酚酸A与HepG2细胞共同孵育6小时后,与对照组相比,中、高浓度药物组二相酶NQO1、HO-1、GST蛋白表达显著升高（P<0.01）,转录因子Nrf2蛋白表达上调（P<0.01）,并有剂量依赖性;Keap1蛋白表达则明显下调（P<0.01）,与二相酶及Nrf2的蛋白表达呈负相关。提示丹酚酸A对二相酶的上调是通过激活Nrf2的核易位而实现。3.Nrf2-624干扰序列转染HepG2细胞48小时后,与对照组相比,明显抑制Nrf2的蛋白表达（P<0.01）;给予丹酚酸A后,对照组Nrf2蛋白表达水平上调（P<0.01）,而Nrf2 siRNA转染组无明显变化,表明促进Nrf2在正常细胞内表达是丹酚酸A的作用靶点之一。4.采用H2O2刺激HepG2细胞后,与对照组相比,损伤组细胞存活率显著下降（P<0.01）,上清液LDH含量明显增高（P<0.01）,中、高浓度丹酚酸A预处理组细胞存活率明显上升（P<0.01）,低、中、高药物预处理组LDH含量显著增加（P<0.01）,并具有浓度依赖性。显示丹酚酸A对过氧化氢损伤的HepG2细胞具有保护作用。5.与对照组相比,H2O2刺激HepG2细胞后,20μM丹酚酸A组与损伤组NQO1、HO-1、GST和Nrf2蛋白表达明显上升（P<0.01）,表明药物与H2O2均可刺激Nrf2核易位。与损伤组相比,20μM丹酚酸A预处理的H2O2组蛋白表达为最高（P<0.01）,表明丹酚酸A可在细胞受损情况下进一步促进Nrf2核易位和二相解毒酶表达。结论:1.正常情况下,丹酚酸A通过激活Nrf2通路提高HepG2细胞二相解毒酶NQO1、HO-1和GST等基因、蛋白表达及细胞抗氧化能力,并呈现浓度依赖性。2.丹酚酸A对H2O2刺激的HepG2细胞有保护作用,其机制可能与丹酚酸A激活Nrf2通路,进而上调细胞二相解毒酶NQO1、HO-1、GST的表达有关。

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摘要  6-8Abstract  8-10前言  10-11材料与方法  11-16结果  16-33讨论  33-38结论  38-39参考文献  39-43综述  43-50  参考文献  47-50附录  50-51致谢  51

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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