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禽流感H5N1病毒的RNAi研究

作　者: 周凯
导　师: 赵宝华；何宏轩
学　校: 河北师范大学
专　业: 遗传学
关键词: RNA干扰禽流感体外转录载体
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 343次
引　用: 2次
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内容摘要

近几年来的研究表明,一些小的双链RNA分子可以通过作用于靶mRNA而抑制体内特定基因的表达,这种现象称为RNAi（RNA interference）即RNA干扰。自从1998年其机制被初步阐明以来,RNAi一直是分子生物学和遗传学的研究热点。它不仅是体内抵御外界感染的重要保护机制,还可以作为一种基因敲除工具用于遗传学的研究。而且由于RNAi与病毒RNA的密切关系,使得RNAi成为病毒防治的一种有效手段。禽流感是由A型流感病毒引起的禽类烈性传染病,严重威胁世界各地的养禽业,常常造成巨大的经济损失,尤其是H5、H7亚型引起的高致病力禽流感是养禽业的一种毁灭性疾病。NP（nucleocapsid protein）、PA（polymerase PA）和PB1（polymerase subunit PB1）是禽流感病毒的重要的保护性抗原,而且都是保守性基因,适合作为RNA干扰实验的靶基因。本文以禽流感H5N1病毒为实验对象进行RNAi研究,主要内容包括H5N1禽流感病毒的分离与鉴定,RNAi体外转录体系的构建和RNA干扰实验。首先,从病死鸡的气管、肺、输卵管、肝、脾等组织中分离出一株病毒,该病毒可凝集鸡的红细胞,而且此凝集可以被禽流感的特异性血清所抑制。通过对分离株进行琼脂扩散、血凝实验、EID₅₀、MDT（36h）、IvPI（3.5）等生物学试验、空斑试验及电镜观察等,证实该分离株为禽流感病毒高致病力的毒株H5N1。在分离鉴定病毒株的基础上,根据禽流感H5N1的三个基因NP、PA和PB1设计了三对寡核苷酸oligo-NP、oligo-PA、oligo-PB1,并将它们连接到pBabe-Puro上,构建成功三条RNAi体外转录载体:pBabe-NP、pBabe-PA、pBabe-PB1。经过细胞转染后,用嘌呤霉素（puromycin）筛选出稳定转染细胞,病毒感染后进行Real-time PCR和Western Blotting实验,结果表明NP-siRNA和PA-siRNA明显抑制了病毒mRNA的合成和蛋白的表达。

全文目录

引言  4-6
摘要  6-7
Abstract  7-8
缩写词表  8-10
第一章禽流感病毒分子生物学研究进展  10-41
  1.1 禽流感病毒基因编码蛋白的结构和功能  11-19
  1.2 禽流感致病性的分子生物学基础  19-27
  1.3 禽流感及其与人类流感的关系  27-41
第二章 RNAi的研究进展  41-57
  2.1 研究历史  41-42
  2.2 作用机制  42-45
  2.3 作用特点  45-46
  2.4 RNAi的技术路线和实现方法  46-49
  2.5 RNAi的应用及展望  49-57
第三章 H5N1禽流感病毒分离与鉴定  57-68
  1 材料和方法  57-63
  2 结果  63-66
  3 讨论  66-67
  4 小结  67-68
第四章 RNAi体外转录载体的构建和RNA干扰实验  68-82
  1 材料  68-69
  2 方法  69-75
  3 结果  75-80
  4 讨论  80-82
结论  82-83
致谢  83

禽流感H5N1病毒的RNAi研究

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