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IL-15在急性淋巴白血病中的遗传学研究和IL-1α的抗体的制备及相关研究

作　者: 林丹丹
导　师: 刘海燕
学　校: 苏州大学
专　业: 免疫学
关键词: IL-15 SNP ALL 单倍型基因易感性 IL-1α 原核表达多克隆抗体单克隆抗体稳转细胞系
分类号: R733.71
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:白细胞介素-15(IL-15)对于免疫系统及造血细胞的发育和功能起着重要的作用。有研究报道IL-15中的5个单核苷酸多态性位点(SNP),即rs10519612, rs10519613, rs35964658, rs17007695和rs17015014与儿童急性淋巴白血病(ALL)的治疗反应明显相关。在成人ALL中,IL-15的表达与ALL的免疫表型相关。因此,我们认为IL-15的SNP基因多态性可能与成人ALL的易感性相关。方法:IL-15的这5个SNP位点通过PCR-限制性酶切片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)的方法对成人ALL患者和正常对照个体进行基因型分析。这一研究包括121例成人ALL患者和263例正常对照。利用回归分析计算基因型和单倍型与成人ALL患病风险的关系。结果:SNP rs10519612和rs17007695与成人ALL的易感性明显相关(P=0.013和P=0.001)。我们发现rs10519612CC和rs17007695TC基因型分别增加了2倍和2.4倍的ALL患病风险。单倍型分析显示ACAC,CAGT和CCAT与B-ALL的易感性相关,而CCAT则与T-ALL的易感性相关。结论:这些发现说明在汉族人群里IL-15的基因多态性与成人ALL的易感性相关。目的:白细胞介素-1α是促炎症细胞因子,能刺激与炎症相关的基因表达。IL-1α在炎症与肿瘤的发生过程中也起着非常重要的作用。IL-1α在体内有多种形式存在,大多数IL-1α于细胞膜或细胞核中发挥效应,而极少数的IL-1α经Calpain酶切后分泌到胞外,因此很难再体液中检测到IL-1α。核定位的IL-1α能够影响转录活性,天然的膜型的IL-1α具有免疫刺激作用,细胞坏死后释放的IL-1α会促进肿瘤的侵袭和转移。因此,不论是膜型还是释放出的IL-1α都可能在炎症反应中发挥重要作用。本文通过构建小鼠和人的IL-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体和鼠抗人IL-1α单克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定。还构建了野生型、入核型、分泌型及膜型IL-1α的重组慢病毒,并成功筛选建立了这四种类型的Jurkat细胞稳转细胞系。方法:(1)利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏和人外周血单核淋巴细胞的cDNA中扩增出小鼠和人的IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21(DE3)大肠杆菌。利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白,经电洗脱纯化并进行鉴定。(2)小鼠IL-1α重组蛋白免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性。(3)人IL-1α重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术构建杂交瘤细胞,经融合蛋白ELISA和HL-60细胞流式细胞术筛选方法来获得稳定、高效的杂交瘤细胞株;采用小鼠体内腹水诱生法大量制备腹水。经ELISA、流式分析检测腹水单抗的特异性。(4)利用PCR和定点突变PCR技术获得野生型、入核型、分泌型及膜型IL-1α四种类型PCR产物,构建重组慢病毒穿梭质粒,并与其它包装质粒一起感染293T细胞,获得病毒颗粒并感染人急性淋巴白血病细胞Jurkat,流式分选获得阳性率为100%的稳转细胞系。结果:(1)成功构建了小鼠和人的重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达了重组蛋白,并获得了兔抗鼠多克隆抗体和鼠抗人单克隆抗体。多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1:25600。Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α。成功筛选出一株杂交瘤细胞株L-1F12,该单抗亚类为IgMκ。FCM分析表明,该单克隆抗体可以成功用于流式。(2)成功构建了IL-1α四种类型的重组慢病毒穿梭质粒并获得了慢病毒颗粒,建立了Jurkat稳转细胞系。结论:本研究成功制备了IL-1α的多克隆抗体,此抗鼠IL-1α多克隆抗体可特异性识别鼠IL-1α蛋白,从而可以用于体内的中和试验,为深入研究在小鼠模型中从肝脏慢性炎症到肝硬化再到肝癌的过程中,释放出的IL-1α对免疫系统以及肿瘤发生的影响。我们也在进一步检测抗人IL-1α单克隆抗体的特异性,希望自主研发试剂盒进行肝癌患者血清IL-1α的检测。构建的稳转细胞系有助于进一步研究不同类型的IL-1α与白血病发生发展的关系,以及对不同免疫细胞亚群数量、迁移以及功能的影响及机制;并研究在白血病发生过程中,膜型的IL-1α是否促进了抗肿瘤免疫反应,以及释放出的IL-1α及入核的IL-1α在促进白血病发生过程中对免疫系统的影响。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-11
综述：白细胞介素-1 与肿瘤  11-22
  参考文献  18-22
第一部分 IL-15 基因多态性与成人急性淋巴细胞白血病易感性的研究  22-34
  一、引言  22
  二、材料与方法  22-25
  三、结果  25-29
  四、讨论  29-30
  参考文献  30-34
第二部分 IL-1α的抗体制备及稳转细胞系的构建  34-66
  一、引言  34-35
  二、材料和方法  35-53
  三、结果  53-62
  四、讨论  62-64
  参考文献  64-66
攻读学位期间发表的论文  66-67
附录  67-68
致谢  68-69

IL-15在急性淋巴白血病中的遗传学研究和IL-1α的抗体的制备及相关研究

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