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温敏型生物降解水凝胶载体防龋基因疫苗不同途径免疫SD大鼠的实验研究

作　者: 亓鹏
导　师: 刘建国；杨德琴
学　校: 遵义医学院
专　业: 口腔临床医学
关键词: 基因疫苗 龋病 水凝胶 免疫
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：使用生物降解水凝胶P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)作为载体的防龋基因疫苗pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT经股四头肌注射、颌下腺周注射、鼻粘膜滴注及口服四种不同途径免疫SD大鼠,观察免疫效果,探索水凝胶作为防龋疫苗缓释系统的体系组成及应用。方法：本研究包括三个部分：实验一：重组质粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT及空载体质粒pVAZX1的鉴定和大量制备。先小量抽提重组质粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT及空载体质粒pVAX1。并经限制性内切酶酶切、凝胶电泳鉴定。在鉴定正确后,大量抽提重组质粒并计算其浓度和纯度,保存以备免疫动物。实验二：温敏型生物降解水凝胶P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)表面形态的扫描电镜(SEM)观察,并对其温敏性进行检测和防龋基因疫苗pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT在以水凝胶P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)为载体条件下的体外释放研究。实验三：生物降解水凝胶P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)作为载体的重组质粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT及空载体质粒pVAX1免疫SD大鼠。出生21天的雄性SD大鼠90只,随机分为15组：A组:pVAX1-spap/A股四头肌注射组；B组：pVAX1-spap/A颌下腺注射组；C组：pVAX1-spap/A鼻腔滴注组;D组：pVAX1-spap/A口服组；E组：pVAX1-gtfB/CAT股四头肌注射组;F组：pVAX1-gtfB/CAT颌下腺注射组；G组：pVAX1-gtfB/CAT鼻腔滴注组；H组：pVAX1-gtfB/CAT口服组；I组：pVAX1-spap/A-gtfB/CAT股四头肌注射组；J组：pVAX1-spap/A-gtfB/CAT颌下腺注射组；K组：pVAX1-spap/A-gtfB/CAT鼻腔滴注组;L组：pVAX1-spap/A-gtfB/CAT口服组；M组(阴性对照组)：空载质粒pVAX1股四头肌注射组；N组(阴性对照组)：空载质粒pVAX1+水凝胶口服组；O组(空白对照组)：生理盐水股四头肌注射组；建立龋齿模型；每只SD大鼠按照确定的免疫途径进行免疫,每次剂量为100μg/只,股四头肌注射组、颌下腺注射组和鼻腔滴注组每侧各50μg,对照组M、N、O组遵循上述剂量,第28天开始免疫,每周一次,连续免疫三周；样本采集从免疫开始前一天开始,每周采集一次；处死动物后,称重,解剖分离其心、肝、脾、肺、肾、股四头肌、颌下腺、胃等脏器,进行病理检查；取上下颌骨,进行龋损评定,根据Keyes经典评分方法进行评估；采用酶联免疫吸附实验(间接ELISA法)检测血液和唾液中IgG和S-IgA抗体水平。结果：①使用试剂盒抽提出符合实验要求的重组质粒pVAXl-spap/A, pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT及空载体质粒pVAX1。②生物降解水凝胶P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)在37℃发生溶液相-凝胶相转变。重组质粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT能够在水凝胶P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)为缓释系统的体系中缓慢释放。③以生物降解水凝胶P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)为载体的重组质粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT缓释系统在免疫SD大鼠后,可以诱导S-IgA型特异性抗体和IgG型特异性抗体均明显升高,并持续数周。④实验组与对照组相比,龋损明显降低,具有统计学意义(P<0.05)。结论：①本实验证明温敏型生物降解水凝胶P(CL-GA)-PEG-P(CL-GA)具有温度敏感性,在37℃时发生溶液相—凝胶相的转变；②防龋基因疫苗pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT和pVAX1-spap/A-gtfB/CAT在水凝胶作为缓释系统的条件下,可以有效地减缓质粒DNA的释放,起到缓释作用；③防龋基因疫苗pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAXl-spap/A-gtfB/CAT在水凝胶作为缓释系统的条件下,能诱导SD大鼠的血液和唾液中特异性抗体的产生,抑制大鼠龋齿的发生。

全文目录


英文缩略词表  5-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
前言  11-13
实验一  13-23
  材料  13-14
  方法  14-18
  结果  18-21
  讨论  21-22
  结论  22-23
实验二  23-43
  材料  27
  方法  27-29
  结果  29-38
  讨论  38-42
  结论  42-43
实验三  43-65
  材料  43-44
  方法  44-51
  结果  51-62
  讨论  62-64
  结论  64-65
全文总结  65-66
参考文献  66-69
综述  69-82
  参考文献  78-82
致谢  82-83
作者简历  83-85
附表  85-89

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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