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胚脑细胞的玻璃化冻存及其对细胞活性的影响

作　者: 赵玉勤
导　师: 胡军祥
学　校: 浙江大学
专　业: 生理学
关键词: 玻璃化冻存胚脑细胞玻璃化溶液回收率存活率琥珀酸脱氢酶(SDH)活性超氧化物歧化酶(SOD) 活性
分类号: Q952
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

本文以孕17～19天的SD大鼠为实验材料，进行玻璃化冻存大鼠胚脑细胞的研究。通过对各种玻璃化溶液毒性的测定和检测平衡时间对所冻存胚脑细胞活性的影响，分析低温保护剂对细胞作用；通过检测冻存后胚脑细胞的回收率、存活率细胞内SDH酶和SOD酶活性以及膜结构和功能的变化，筛选出适合胚脑细胞玻璃化冻存的玻璃化溶液和玻璃化冻存程序，并初步分析了作用机理，实验结果表明： (1)低温保护剂对细胞作用的分析：细胞外非渗透性保护剂的大分子物质Ficoll和蔗糖，对胚脑细胞均不产生毒性作用。对细胞的化学毒性作用来自渗透性保护剂DMSO和EG，并且随处理时间的延长和其浓度的增加对细胞的影响逐渐增大，而且由渗透性保护剂不同的玻璃化溶液之间毒性的比较可知DMSO的毒性要比EG大。虽然渗透性保护剂DMSO毒性较大，但DMSO具有较强的玻璃化形成能力，能更好的促进细胞玻璃态的形成，与EG合理搭配，能够在冷冻过程中较好地形成玻璃化，达到较好的冻存效果。 (2)玻璃化溶液的筛选：通过对冻存后胚脑细胞回收率、存活率、FDA／PI值、SDH活性和SOD活性检测，分析认为玻璃化溶液VS2对大鼠胚脑细胞的冻存效果较好，其成分为：15％EG(v／v)，15％DMSO(w／v)，21％Ficoll和0.35M蔗糖。用VS2冻存的胚脑细胞在3、7、15和30天时，胚脑细胞的存活率分别为：86.22±2.73％、79.61±2.48％、69.46±2.68％、52.85±2.51％和51.29±3.19％，高于其它冻存组。冻存30天后胚脑细胞的存活率和各项生理功能达到相对稳定的状态。 (3)胚脑细胞玻璃化冻存后结构与功能的变化：对冻存后胚脑细胞活力的各方面，如膜结构、SDH和SOD活性等进行了初步研究，从各项指标来看，在玻璃化冻存过程中，在冻存的前15天中，细胞的膜损伤、酶活性的下降程度最明显，细胞的各项功能指标都发生了较为明显的下降；但在冻存30天以后，细胞的各项生理功能都达到相对稳定的状态，各项指标的不再随着冻存时间的延长而下降。表明玻璃化冻存方法适用于长期低温保存胚脑细胞。虽然我们所做的玻璃化冻存研究不能完全避免冷冻对胚脑细胞产生的损伤，勿浙江大学硕士学位论文但冻存后的胚脑细胞仍保持其较高和较稳定的存活率和活性，因此，该项技术对胚脑细胞的长期低温保存，具有一定的应用价值。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
一、前言  9-13
二、材料与方法  13-16
  1 主要试剂  13
  2 主要仪器  13
  3 实验材料  13
  4 实验方法  13-14
    4.1 胚脑细胞单细胞悬液的制备  13-14
    4.2 胚脑细胞的玻璃化冻存  14
  5 玻璃化冻存液毒性的检测和不同的预平衡时间对胚脑细胞活性的影响  14-15
    5.1 玻璃化冻存液毒性的检测  14
    5.2 不同的预平衡时间对细胞存活率的影响  14-15
  6 玻璃化冻存后对细胞活性的影响  15-16
    6.1 台盼蓝拒染法检测胚脑细胞回收率和存活率  15
    6.2 FDA-PI双荧光染色法检测胚脑细胞活性  15
    6.3 MTT法检测胚脑细胞琥珀酸脱氢酶(SDH)活性  15
    6.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性检测  15-16
  7 统计学处理  16
三、实验结果  16-29
  1 玻璃化冻存液毒性的检测和预平衡时间对胚脑细胞活性的影响  16-22
    1.1 玻璃化冻存液毒性的检测  16-20
    1.2 预平衡时间对细胞存活率的影响  20-22
  2 玻璃化冻存后对细胞活性的影响  22-29
    2.1 不同玻璃化冻存液对胚脑细胞回收率的影响  22-23
    2.2 不同玻璃化冻存液对胚脑细胞存活率的影响  23-25
    2.3 FDA-PI双荧光染色法检测胚脑细胞活性  25-26
    2.4 MTT法检测胚脑细胞琥珀酸脱氢酶(SDH)活性  26-28
    2.5 超氧化物歧化酶(SOD)活性检测  28-29
四、讨论  29-34
小结  34-36
参考文献  36-39
文献综述  39-52

胚脑细胞的玻璃化冻存及其对细胞活性的影响

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