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人鼠嵌合的HLA-A2/H-2K~b-Fc二聚体的构建、表达与鉴定

作　者: 李庆
导　师: 吴雄文
学　校: 华中科技大学
专　业: 免疫学
关键词: 嵌合 HLA-A2/H-2K~b-Fc 融合蛋白重叠PCR
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

MHCⅠ类分子一般含两条多肽链:一条是重链α,包括α1、α2和α3三个结构域;另一条是轻链β2微球蛋白。其中α1和α2区构成MHCⅠ类分子的肽结合槽,其为MHCⅠ类分子与抗原肽结合的部位以及Ⅰ类分子被T细胞TCR识别的部位;α3结构域的序列高度保守,为β2m与T细胞表面CD8分子的结合部位,α3结构域与β2m和CD8分子的稳定结合对维持Ⅰ类分子天然构型的稳定性及发挥生物功能具有重要的意义。在前期工作中,我们证明HLA-A2二聚体可有效的在体外抑制同种反应,C57BL/6来源的HLA-A2转基因小鼠（H-2K^b）的出现为探索HLA-A2二聚体抗移植排斥反应提供了体内研究的动物模型。但是在用HLA-A2多聚体检测HLA-A2转基因小鼠产生的特异性T细胞时,由于小鼠CD8分子与人HLA I类分子的α3结构域的结合效率较低,造成HLA-A2多聚体检测特异性T细胞的效率低。为了提高HLA-A2多聚体与HLA-A2转基因小鼠的特异性T细胞的结合效率,我们拟构建与表达HLA-A2/H-2K^b-Fc二聚体,该二聚体由HLA-A2的α1和α2区、小鼠H-2K^b的α3区和β2m,以及IgG2a的Fc段组成。此融合蛋白将会为后续的HLA-A2/H-2K^b转基因鼠皮肤移植研究提供基础。本研究的主要内容及结果如下:1. HLA-A2/H-2K^b-Fc二聚体的构建通过重叠PCR,将HLA-A2的α1-α2区和H-2K^b的α3区重组获得HLA-A2/H-2K^b融合基因;利用酶切连接方法将β2m、HLA-A2/H-2K^b融合基因和IgG2a-Fc段按顺序分别插入到pFastBac^TMDual的双启动子下游,得到pFastBac^TMDual[HLA-A2/H-2K^bFc&β2m]重组质粒。经过限制性酶切鉴定和测序结果分析证实pFastBac^TMDual[HLA-A2/H-2K^bFc&β2m]的基因序列完全正确,表明pFastBac^TMDual[HLA-A2/H-2K^bFc&β2m]重组质粒构建成功。将pFastBac^TMDual[HLA-A2/H-2K^bFc&β2m]重组质粒转化含有Bacmid的DH10大肠杆菌,由辅助质粒提供反式作用,将目的基因重组到杆状病毒Bacmid基因组中,形成重组的Bacmid大质粒。经过特异性PCR检测到目的基因插入了Bacmid质粒中。2. HLA-A2/H-2K^b-Fc二聚体的表达、纯化与鉴定将重组了pFastBac^TMDual[HLA-A2/H-2K^bFc&β2m]的Bacmid质粒利用cellfection2000脂质体转染草地贪夜蛾sf9昆虫细胞,得到了含有HLA-A2/H-2K^bFc&β2m的重组病毒上清,然后用收集的上清再去感染sf9细胞。在病毒复制过程中也在不断的分泌目的蛋白,在确定感染成功后大量收集上清。利用SPA柱纯化浓缩感染病毒上清,纯化后的蛋白用ELISA、Westernblotting及流式细胞仪检测证实蛋白具有正确的分子量和构像。本研究构建的HLA-A2/H-2K^bFc&β2m（后面简称之为HLA-A2/ KbFc）重组蛋白是以人鼠嵌合形式存在的,通过小鼠α3区与小鼠CD8有效的结合从而提高HLA-A2/H-2K^bFc分子与TCR的亲和力。又由于二聚体形式存在的HLA-A2/H-2K^bFc分子与T细胞的亲和力要远高于单体,因此成功构建表达HLA-A2/H-2K^b-Fc二聚体为在HLA-A2转基因小鼠移植模型中研究急性排斥反应的机制与干预措施提供了很好的物质基础。

全文目录

英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-11
前言  11-14
第一部分 HLA-A2/H-2K~b-Fc 二聚体的构建  14-42
  材料与方法  14-33
  结果  33-39
  讨论  39-42
第二部分 HLA-A2/H-2K~b-Fc 二聚体的表达、纯化与鉴定  42-58
  材料与方法  42-51
  结果  51-54
  讨论  54-57
  小结  57-58
参考文献  58-60
综述  60-72
  参考文献  67-72
致谢  72

人鼠嵌合的HLA-A2/H-2K~b-Fc二聚体的构建、表达与鉴定

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