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细粒棘球绦虫EgAgB8/1重组抗原和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合抗原表达系统的构建和血清学诊断价值的比较

作　者: 古力帕丽·麦曼提依明
导　师: 吾拉木·马木提
学　校: 新疆医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 细粒棘球绦虫 AgB8/1重组抗原 AgB8/1-AgB8/2嵌合重组抗原 血清学诊断
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：构建pET32a-EgAgB8/1原核表达载体和pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2原核表达载体,并诱导表达和纯化细粒棘球绦虫EgAgB8/1重组抗原和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合抗原,比较两个重组蛋白对囊型包虫病(CE)的血清学诊断价值。方法：从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板,用基因特异性引物分别扩增EgAgB8/1和EgAgB8/2基因编码其分泌型多肽的片段,经测序后,以此两条基因片段为依据,扩增EgAgB8/1抗原编码核酸序列和人工合成EgAgB8/1-EgAgB8/2嵌合抗原编码核酸序列,分别克隆至pMDl8-T载体,测序鉴定其正确性。通过对pMD18-T/EgAgB8/1重组质粒和pMD18-T/EgAgB8/1-EgAgB8/2重组质粒分别进行双酶切,将获得的EgAgB8/1抗原编码核酸序列和EgAgB8/1-EgAgB8/2嵌合抗原编码核酸序列,用定向克隆技术克隆至原核表达质粒pET32a上,测序鉴定插入片段正确性后,转化至E.coli BL21 (DE3) LysS,IPTG诱导pET32a-EgAgB8/1和pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2原核表达质粒,表达和纯化EgAgB8/1重组蛋白和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合蛋白,用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白,并通过超声裂解法进行纯化,Western blot法分别检测两个重组蛋白与中间宿主CE病人的血清学反应情况。结果：测序表明,EgAgB8/1抗原编码核酸序列和EgAgB8/1-EgAgB8/2嵌合抗原编码核酸序列均正方向插入至pET32a(+)质粒。SDS-PAGE电泳分析显示,细粒棘球绦虫pET32a-EgAgB8/1和pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2原核表达质粒得到成功的诱导表达,分别在蛋白分子量约28kDa和38kDa处有表达条带,通过超声裂解法获得了纯化的重组蛋白。Western blot结果表明,EgAgB8/1重组蛋白和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合蛋白均能被CE病人血清特异性的识别。16例CE病人血清中,EgAgB8/1重组蛋白11例呈阳性反应,EgAgB8/1-EgAgB8/2重组蛋白13例呈阳性反应。同时,用EgAgB8/1和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组蛋白检测12例囊虫病人的血清,EgAgB8/1重组蛋白出现5例阳性反应,EgAgB8/1-EgAgB8/2重组蛋自出现3例阳性反应。结论：成功构建了pET32a-EgAgB8/1原核表达质粒和pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2原核表达质粒,诱导表达和纯化出EgAgB8/1重组蛋白和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合蛋白,Western blot结果表明,EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合蛋白对囊型包虫病的血清学诊断价值优于EgAgB8/1重组蛋白。

全文目录


摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
前言  12-14
材料与方法  14
1. 材料  14-20
2. 实验方法  20-29
  2.1 细粒棘球绦虫原头蚴总RNA的提取及第一链cDNA合成  20-21
    2.1.1 提取总RNA  20-21
    2.1.2 第一链cDNA合成  21
  2.2 EgAgB8/1、EgAgB8/1-EgAgB8/2编码基因的克隆及鉴定  21
    2.2.1 EgAgB8/1目的基因片段的克隆和鉴定  21
    2.2.2 EgAgB8/1-EgAgB8/2目的基因片段的克隆和鉴定  21
  2.3 重组质粒pMD18-T/EgAgB8/1、pMD18-T/EgAgB8/1-EgAgB8/2的构建及鉴定  21-23
    2.3.1 重组质粒的构建  21-23
    2.3.2 重组质粒的鉴定  23
  2.4 EgAgB8/1、EgAgB8/1-EgAgB8/2抗原目的基因序列的测定及分析  23-24
  2.5 原核表达质粒pET32a-EgAgB8/1和pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2的构建  24-25
    2.5.1 提取空质粒pET32a,pMD18-T/EgAgB8/1及pMD18-T/EgAgB8/1-EgAgB8/2  24
    2.5.2 双酶切空质粒pET32a和pMD18-T/EgAgB8/1及pMD18-T/EgAgB8/1-EgAgB8/2重组质粒  24-25
    2.5.3 胶回收目的片段  25
    2.5.4 pET32a双粘质粒分别与双粘靶片段EgAgB8/1及EgAgB8/1-EgAgB8/2连接  25
    2.5.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备与重组子的细菌转化  25
    2.5.6 重组质粒pET32a-EgAgB8/1和pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2的筛选与鉴定  25
    2.5.7 重组质粒pET32a-EgAgB8/1和pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2的序列测定和分析  25
  2.6 重组蛋白的诱导表达  25-27
    2.6.1 pET32a-EgAgB8/1重组抗原的表达  25-26
    2.6.2 pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2重组抗原的表达  26
    2.6.3 重组蛋白的SDS-PAGE检测  26-27
  2.7 pET32a-EgAgB8/1和pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2重组抗原的纯化  27
  2.8 重组蛋白的Western blot反应  27-29
结果  29-39
讨论  39-42
小结  42-43
致谢  43-44
参考文献  44-48
综述  48-58
  参考文献  54-58
攻读硕士学位期间发表的学位论文  58-59
导师评阅表  59

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 诊断学 > 实验室诊断 > 免疫学检验
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