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小鼠重组sTNF-α的构建、表达及其蛋白纯化

作　者: 赵贤贤
导　师: 李卓娅；尹丙姣
学　校: 华中科技大学
专　业: 免疫学
关键词: 鼠分泌型TNF融合蛋白纯化
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

肿瘤坏死因子(TNF-α)是一种主要由活化的单核/巨噬细胞产生的多效性细胞因子,可介导不同靶细胞增殖、分化、坏死及凋亡,具有广泛的免疫调节作用和病理生理作用,它在体内以跨膜型(Transmembrane TNF-α, mTNF-α)和分泌型(secreted TNF-α, sTNF-α)两种形式发挥作用[1-4]。近来研究报道,在慢性炎症的局部和肿瘤组织中聚集有大量的未成熟髓样抑制细胞(myeloid derived suppressor cell,MDSC),包括未成熟的巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞等,具有很强的免疫抑制作用,是引起肿瘤免疫逃逸的重要细胞群体[5-8]。有研究发现:MDSC浸润肿瘤组织后可分化为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和血管内皮细胞[9],这两类细胞又是肿瘤组织中主要的基质细胞,能分泌大量TNF-α,TAM表达的跨膜型TNF-α能通过细胞间直接接触而介导活化的CD8+T细胞凋亡,这些数据提示MDSC的聚集及其免疫抑制功能很与TNF-α有关。为研究跨膜型和分泌型TNF-α对髓样抑制细胞功能的影响及其机制,本课题构建了鼠sTNF-pTriex4hisC重组质粒并高效表达了鼠sTNF-α重组蛋白,为后续的科研工作创造了条件。一、WT-TNF-pcDNA3.1C重组质粒的构建及鉴定1.提取小鼠腹腔巨噬细胞的总RNA,采用RT-PCR扩增出野生型TNF-α(WT-TNF)的cDNA片断;同时,抽提质粒pcDNA3.1C,将二者分别用BamHI和EcoR I双酶切后,经回收、连接、转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆。2.阳性克隆的鉴定:以菌落PCR初步筛选阳性克隆,再用上述限制性内切酶双酶切鉴定,结果显示重组体经酶切后,得到约708bp左右的目的片断,与连接的目的基因大小一致。进一步经DNA测序分析鉴定,证明成功构建了插入有WT-TNF全长序列的重组质粒鼠WT-TNF-pcDNA3.1C。二、sTNF-pTriex4hisC重组质粒的构建及鉴定1.重组体的构建和克隆:以WT-TNF-pcDNA3.1C质粒为模板,采用重叠PCR方法删除WT-TNF中的信号肽序列,从而得到仅仅只含有分泌型TNF-α的DNA序列片段,再用BamHI和EcoR I将该目的基因和pTriex4hisC载体(此载体中含组氨酸his标签,有利于后续的蛋白纯化)进行双酶切,然后,经回收、连接、转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆。2.阳性克隆的鉴定:以菌落PCR初步筛选阳性克隆,再用上述限制性内切酶双酶切进行鉴定,结果显示重组体经酶切后,得到约471bp左右的目的片断,与连接的目的基因大小一致。进一步经DNA测序分析鉴定,证明成功构建鼠sTNF-pTriex4hisC重组质粒。三、鼠sTNF-α融合蛋白的诱导表达及鉴定将sTNF-α-pTriex4hisC重组质粒转染大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导,获得鼠融合蛋白sTNF-α;用Ni2+-NTA介质分离纯化sTNF-α蛋白后,经SDS-PAGE凝胶电泳及western blot鉴定显示,上述纯化的蛋白确为小鼠sTNF-α蛋白,且纯度较高。

全文目录

缩略词表  5-7
中文摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
前言  12-14
材料与方法  14-32
结果  32-43
讨论  43-46
其它工作  46-50
小结  50-51
参考文献  51-53
综述  53-66
  参考文献  63-66
致谢  66

小鼠重组sTNF-α的构建、表达及其蛋白纯化

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