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人胰岛素样生长因子结合蛋白-3基因编码序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达

作　者: 辛兢
导　师: 张镜宇
学　校: 天津医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 胰岛素样生长因子-1 人胰岛素样生长因子结合蛋白-3 逆转录PCR 糖尿病细胞凋亡基因工程
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)是一种多功能的内分泌因子,是该家族的重要成员,是人类血液中数量最多、作用最强的IGFBP,可结合血液中95%-99%的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)。重组人IGF-1 (rhIGF-1)早已被应用于治疗侏儒症,并发现IGF-1对于糖尿病、神经损伤、和骨质疏松症也有治疗作用。但已有报道证明单独应用rhIGF1治疗时,可引发一些轻度和中度不良反应,包括四肢浮肿、头疼、关节疼、下颚触痛、体位性低血压、视神经水肿等。IGFBP-3可使IGF-1的半衰期延长,控制IGF-1的生物利用度而使不良反应显著减少。rhIGF-1和rhIGFBP-3合并成复合物使用,当可成为提高药效降低副作用之最佳方案。而后者也有望被开发为一种新药,并具有广泛的应用前景。与此同时多年研究确认IGFBP-3是细胞凋亡的诱导物,这一作用是独立于IGFs之外的。IGFBP-3具有促细胞凋亡、抑制细胞生长、增强癌细胞的放射敏感性等作用,IGFBP-3对生长失控细胞的作用机制,已成为抗肿瘤治疗研究的一个新热点。而国内对于IGFBP-3的研究,仅限于将其作为糖尿病、肿瘤等的标志物,而对于表达纯化及功能方面的报道甚少。我实验室已成功构建了IGF-1的高效表达系统。本文目的旨在建立IGFBP-3的原核表达系统,为进一步深入研究IGFBP-3提供条件。我们提取人肝组织总RNA,逆转录聚合酶链反应扩增IGFBP-3的cDNA,经巢式PCR扩增得到目的片段。将其克隆入pGEM-T Easy载体。测序证实序列正确后,将目的基因插入融合型原核表达载体pQE-30Xa,将己构建好的表达载体pQE-30Xa/ IGFBP-3重组质粒转化大肠杆菌M15,异丙基硫代-8-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。采用亲和层析法纯化目的蛋白。ELISA法测定rhIGFBP-3与IGF-1的结合活性。MTT法检测rhIGFBP-3对Hela细胞增殖的影响。结果SDS-PAGE可见与预期大小相符的蛋白条带,Western Blot证实该条带即为rhIGFBP-3。经纯化后,用Chemi Genius凝胶成像分析系统分析,重组蛋白的纯度超过95%。生物活性研究显示它有抑制Hela细胞增殖的作用,且在体外具有与IGF-1结合的活性。我们成功建立了rhIGFBP-3的高效表达系统,rhIGFBP-3的表达量可达到菌体总蛋白量的50.2%,而且具有很好的生物学活性。

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中文摘要  4-5
Abstract  5-8
符号说明  8-10
前言  10-15
  研究现状、成果  10-14
  研究目的、方法  14-15
1 对象和方法  15-35
2 结果  35-44
3 讨论  44-50
结论  50-51
参考文献  51-58
发表论文和参加科研情况说明  58-59
附录  59-63
综述  63-73
  综述参考文献  69-73
致谢  73

人胰岛素样生长因子结合蛋白-3基因编码序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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