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稗草病原菌的生物学评价和利用研究

作　者: 段桂芳
导　师: 余柳青
学　校: 中国农业科学院
专　业: 微生物学
关键词: 稗草病原菌生物学评价诱变原生质体融合固体发酵
分类号: S451
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

稗草微生物防治环境相容性好，保护农田生态平衡，不易产生抗(耐)性杂草，是生产无公害水稻和农业可持续发展战略的重要手段之一。本研究目的是筛选一种微生物除稗剂潜力菌，明确其生物学特性，探索物理和化学诱变以及原生质体融合等育种技术在微生物除稗剂研究中的可行性，开辟微生物除稗剂研究开发的新途径，并对潜力菌的固体发酵生产工艺进行研究，为该菌的进一步开发应用打下基础。论文研究获得的主要成果：筛选获得具有很大开发应用前景的微生物除稗剂潜力菌——内脐蠕孢菌(Dm)菌；该菌通过物理和化学诱变，获得产孢量高的突变菌株；筛选到稗茎叶农业基础物质可以作为Dm菌固体发酵大量生产孢子的固体培养基。论文的主要结论如下：从自然感病稗草标样上分离到4种稗草病原菌：链格孢菌(Alternaria alternata,简称Aa)，弯孢菌(Curvularia lunata，简称Cl)，内脐蠕孢菌(Drechslera monoceras，简称Dm)和突脐蠕孢菌(Exserohilum monoceras，简称Em)。比较了4种菌的孢子产量，菌丝体产量，杀草活性及寄主选择性，C1菌产孢量高，但对水稻致病；Aa菌产孢量高，对水稻安全，但对稗草的致病力较低；Em菌产孢量低，引起玉米轻度感病和高梁感病，但杀草活性高；Dm菌产孢量高于Em菌，对稗草致病力强，对水稻安全，只引起高梁和大麦轻度感病，选择Dm菌为微生物除稗剂潜力菌。 Dm菌孢子在PDA平板上28℃恒温下很快萌发，培养66h后产生新的孢子。Dm菌在PDA培养基上生长和产孢的适宜条件是：28℃，pH值为6～7，连续黑暗及氧气供应充足。 Dm菌经0.2mg/mlNTG诱变处理20min后，筛选获得突变菌株1262，其产孢量比出发菌株高出30％以上；1262菌株的孢子悬液经γ射线辐照(650Gy 57min)后，获得菌株FⅡ 116、FⅡ 121和FⅡ140，3菌株孢子产量均比1262菌株高出45％以上；1004菌株是Dm原始菌株经亚硝基胍(NTG)诱变获得的Tyr~-、His~-营养双缺陷型菌株。1004菌株原生质体制备的适宜条件是：孢子悬液在28～30℃120r/min振荡培养48h，收集菌丝，无菌研细，将菌丝段接种于新鲜液体培养基继续培养，收集菌龄42h的菌丝，以0.7mol/LKCl为渗透压稳定剂，加入2％溶壁酶和2％纤维素酶混合酶液(pH4.4～5.8)在30℃恒温水浴中处理4h左右，可以获得原生质体 IXIO‘个hl以上，原生质体再生率为 0．15％。CI菌原生质体制备的适宜条件是：抱子悬液在 28～30oC 120r／min振荡培养 24h，收集菌丝，无菌研细，将菌丝段接种于新鲜液体培养基继续培养，收集茵龄 18h的菌丝，以 0．7mol几 KCI为渗透压稳定剂，在 2％溶壁酶和 4％纤维素酶混合酶液一～5．8）中 30oC酶解4巧，可以获得原生质体 1．7xlo勺ml，原生质体再生率为0．76％；CI菌原生质体在60℃灭活6min后，与等量 1004菌株原生质体充分混合，力人30％P＊G（含0．01＊。1／C。CLpHS刀）促融合，结果未能获得融合子。筛选到价格低廉的稗茎叶可作为Din菌固体发酵大量抱子生产的良好农业基础物质；高浓度抱子悬液接种法能产生较多抱子；稗茎叶培养基水分含量80一卯％适合于大量产抱。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
目录  8-11
第1章文献综述  11-23
  1 杂草生物防治的概念及方法  11-12
    1．1 杂草生物防治的概念  11
    1．2 杂草生物防治的方法  11-12
  2 杂草微生物防治的研究  12-17
    2．1 利用微生物活体防治杂草  12-15
      2．1．1 传统式途径的研究  12-13
      2．1．2 生物除草剂的研究  13-15
    2．2 利用微生物天然产物防治杂草的研究  15-17
  3 微生物除稗剂的研究  17-21
    3．1 国外稗草生物防治的研究进展  17-20
    3．2 国内稗草生物防治研究现状  20-21
  4 微生物除草剂商品化存在的问题  21
  5 展望  21-22
  6 本研究的目的和内容  22-23
第2章材料和方法  23-30
  1 材料  23-24
    1．1 菌种  23
    1．2 培养基  23
    1．3 诱变剂  23
    1．4 脱壁酶  23
    1．5 渗透压稳定剂  23-24
    1．6 30％PEG（分子量6000）  24
  2 方法  24-30
    2．1 四菌生物学评价  24-25
      2．1．1 产孢量比较  24
      2．1．2 菌丝体产量比较  24
      2．1．3 杀草活性比较  24-25
      2．1．4 作物选择性比较  25
    2．2 潜力菌生物学特性研究  25-26
      2．2．1 温度对Dm菌生长和产孢的影响  25
      2．2．2 pH值对Dm菌生长和产孢的影响  25
      2．2．3 光照对Dm菌生长和产孢的影响  25
      2．2．4 氧气含量对Dm菌生长和产孢的影响  25-26
    2．3 菌种改良  26-29
      2．3．1 亚硝基胍诱变  26-27
      2．3．2 ~（60）C_0-γ射线辐射诱变  27
      2．3．3 原生质体融合  27-29
    2．4 固体发酵工艺初探  29-30
      2．4．1 农业基础物质固体培养基的筛选  29
      2．4．2 接种方法的影响  29
      2．4．3 水分含量的影响  29-30
第3章结果与分析  30-49
  1 四菌生物学评价  30-34
    1．1 产孢量比较  30
    1．2 菌丝体产量比较  30
    1．3 杀草活性比较  30-33
      1．3．1 孢子杀草活性比较  30-31
      1．3．2 菌丝杀草活性  31-32
      1．3．3 发酵液杀草活性  32-33
    1．4 作物选择性比较  33-34
  2 Dm菌的生物学特性  34-38
    2．1 Dm菌培养性状及生长过程观察  34-35
    2．2 Dm菌在PDA上的径向生长曲线  35
    2．3 Dm菌在PDA斜面上的产孢速度  35-36
    2．4 温度对Dm菌生长和产孢的影响  36
    2．5 pH值对Dm菌生长和产孢的影响  36-37
    2．6 光照对Dm菌生长、产孢的影响  37-38
    2．7 氧气含量对Dm菌生长、产孢的影响  38
  3 菌种改良  38-46
    3．1 NTG诱变最适诱变剂量  38
    3．2 突变菌株的筛选结果  38-40
    3．3 γ射线（~（60）C_0）辐照诱变的突变菌株筛选结果  40-42
    3．4 原生质体制备  42-46
      3．4．1 菌龄的影响  42
      3．4．2 酶解时间的影响  42-43
      3．4．3 酶液浓度对原生质体形成的影响  43-44
      3．4．4 渗透压稳定剂的影响  44-45
      3．4．5 酶解温度的影响  45
      3．4．6 缓冲液PH值对原生质体形成的影响  45-46
    3．5 Cl菌株原生质体灭活时间确定  46
    3．6 原生质体的再生  46
    3．7 原生质体融合  46
  4 Dm固体发酵工艺初探  46-49
    4．1 农业基础物质固体培养基的筛选  46-47
    4．2 接种方法的影响  47
    4．3 水份含量的影响  47-49
第4章讨论  49-52
第5章结论  52-53
参考文献  53-63
致谢  63

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