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牛卵泡卵母细胞体外受精的研究

作　者: 魏红芳
导　师: 昝林森；徐照学
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 牛卵泡卵母细胞体外成熟体外受精体外培养
分类号: S823.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

本研究利用屠宰黄牛卵巢，对卵巢表面2～6n皿卵泡卵母细胞的体外成熟(IVM)一体外受精(IVF)—受精卵的体外发育(IVD)进行了系列研究，并探讨了其影响因素，结果表明： (1)采用TCM-199与添加10％发情牛血清(ECS)培养牛卵泡卵母细胞，获得了较高的卵母细胞体外成熟率(81.39％)、卵裂率(56.05％)和桑囊率(30.94％)，进一步证明在体外成熟培养液中单独添加10％的ECS是可行的，适宜在生产中推广应用。 (2)在卵母细胞体外成熟培养液和早期胚胎培养液中分别添加0.5μg／ml的谷胱甘肽(GSH)，能够提高受精卵的桑椹胚及囊胚的发育能力。这表明GSH对牛胚胎的发育有一定的保护和促进作用。 (3)在卵母细胞成熟培养液(TCM-199+10％ECS)中添加1μg／ml表皮生长因子(EGF)，可以明显地提高卵母细胞的体外成熟率、卵裂率，表明体外成熟培养液中添加EGF对卵母体外成熟和卵裂有良好的促进作用。 (4)对冻精的处理方法中的直接离心洗涤法、上游法和Percoll法进行了比较实验，结果显示，Percoll法与洗涤法之间卵裂率差异显著(P＜0.05)；而上游法与洗涤法的桑囊率差异显著(P＜0.05)，但Percoll法与上游法的卵裂率和桑囊率差异均不显著(P＞0.05)。这表明在胚胎体外生产中，Percoll法与上游法都可采用。 (5)比较了在早期胚胎培养液中添加0.1mS／ml谷氨酰胺(Gln)与联合添加谷氨酰胺和表皮生长因子(EGF)对牛胚胎体外发育的影响，结果表明联合添加Gln与EGF可以提高胚胎4-8细胞发育率，而且可以显著促进桑囊胚的发育。 (6)建立了相对比较实用且有效的牛卵泡卵母细胞IVM—IVF—IVC程序：卵母细胞在TCM-199+10％ECS+1μg／mlEGF的成熟培养液中培养23～24h；冻精用BO液配制的30％及45％Percoll液进行洗涤(加有3mg／ml BSA和10μg／ml肝素钠)，精卵在受精液(另加有5mM咖啡因)中共同孵育6-8小时；将受精卵从受精液中移入TCM-199+10％ECS+1μg／mlEGF+0.1mg／mlGln中与颗粒细胞单层(GCM)共同培养，直到发育至桑椹胚或囊胚。

全文目录

第一部分文献综述  8-34
  §1 卵母细胞IVM—IVF—IVC研究历史回顾  8-11
  §2 卵泡卵母细胞的获取与体外成熟培养  11-20
    §2．1 卵泡卵母细胞的获取  11
      §2．1．1 屠宰后卵巢上采集  11
      §2．1．2 活体卵巢上采集  11
    §2．2 卵母细胞的体外成熟  11-20
      §2．2．1 卵母细胞体外成熟的特征  11-13
      §2．2．2 细胞质成熟与卵母细胞成熟  13
      §2．2．3 影响卵母细胞体外成熟的因素  13-19
        §2．2．3．1 卵母细胞来源  13-14
        §2．2．3．2 卵母细胞体外成热培养体系  14-19
      §2．2．4 卵母细胞体外成熟的判定  19-20
  §3 精子体外获能与体外受精  20-28
    §3．1 精子体外获能的机制  20
    §3．2 影响精子体外获能因素  20-22
    §3．3 精子体外能的方法  22-24
      §3．3．1 精子的洗涤  22-24
      §3．3．2 精子体外获能  24
      §3．3．3 精子获能的判定  24
    §3．4 体外受精  24-28
      §3．4．1 授精前卵母细胞的处理  24
      §3．4．2 提高精子活力的措施  24-26
      §3．4．3 精卵比例  26
      §3．4．4 精卵作用时间及培养条件  26
      §3．4．5 影响体外受精的因素  26-27
      §3．4．6 异常受精  27-28
  §4 早期胚胎培养系统  28-32
    §4．1 早期胚胎发育阻断  28
    §4．2 影响早期胚胎体外发育的因素  28-32
      §4．2．1 营养因素  28-31
      §4．2．2 培养环境条件  31-32
  §5 小结与展望  32-34
第二部分试验研究  34-47
  §1 前言  34-35
  §2 材料  35-37
    §2．1 主要仪器及设备  35
    §2．2 主要试剂  35-36
    §2．3 卵巢的采集与保存  36
    §2．4 操作液  36-37
      §2．4．1 采卵液  36
      §2．4．2 卵母细胞成熟培养液  36
      §2．4．3 牛冷冻精液  36
      §2．4．4 冻精洗涤液  36
      §2．4．5 精子获能与受精液  36
      §2．4．6 体外受精胚胎早期培养液  36-37
  §3 方法  37-38
    §3．1 卵泡卵母细胞的采集  37
    §3．2 卵母细胞筛选与成熟培养  37
    §3．3 牛冷冻精子体外获能处理方法  37-38
      §3．3．1 直接离心洗涤法  37
      §3．3．2 上游法  37
      §3．3．3 Percoll法  37-38
    §3．4 体外受精  38
    §3．5 颗粒细胞单层（GCM）制作  38
    §3．6 受精卵的体外发育培养  38
    §3．7 胚胎鉴定  38
    §3．8 统计学分析  38
  §4 结果  38-42
    §4．1 卵巢表面卵泡卵母细胞的回收  38-39
    §4．2 卵泡卵母细胞的体外成熟、体外受精及受精卵的早期培养  39-42
      §4．2．1 成熟培养液中添加不同血清及激素对卵母细胞IVM、IVF及IVD的影响  39
      §4．2．2 谷胱甘肽（GSH）对卵母细胞体外受精后发育的影响  39-40
      §4．2．3 表皮生长因子和激素对卵母细胞IVM、IVF及IVD的影响  40
      §4．2．4 冻精体外洗涤处理方法对卵母细胞体外受精及受精后发育的影响  40-41
      §4．2．5 谷氨酰胺、表皮生长因子对牛体外受精胚胎发育的影响  41-42
  §5 讨论  42-46
    §5．1 不同血清和激素对卵母细胞体外成熟、体外受精及受精后发育的影响  42
    §5．2 GSH对卵母细胞体外受精后发育的影响  42-43
    §5．3 表皮生长因子和激素对卵母细胞体外成熟和受精后胚胎发育的影响  43-44
    §5．4 冻精洗涤处理方法对牛卵母细胞体外受精及受精后发育的影响  44-45
    §5．5 谷氨酰胺，表皮生长因子对牛体外受精胚发育的影响  45-46
  §6 结论  46-47
附图  47-49
参考文献  49-60
致谢  60-61
作者简介  61

牛卵泡卵母细胞体外受精的研究

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