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SCF可溶性受体与IgG-Fc段融合基因（sc-kit-IgG-Fc）真核表达载体的构建及在K562细胞中的表达和作用

作　者: 蔡相颖
导　师: 陈乃耀；刘斌；王大力
学　校: 华北煤炭医学院
专　业: 内科学
关键词: k562细胞 SCF-C-Kit-IgG 稳定转染细胞增殖细胞周期细胞凋亡
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:构建干细胞因子(SCF)可溶性受体与IgG-Fc段真核表达载体,使其在慢性粒细胞白血病细胞(K562)中表达,并探讨该重组质粒(pIRES2-EGFP-SCF-C-Kit-IgG)对K562细胞增殖和凋亡的影响,为干细胞因子在肿瘤靶向治疗中的作用的研究奠定基础。方法:通过循环多聚酶链反应(PCR)技术以人脐静脉内皮细胞和人基因组DNA为模板扩增出SCF可溶性受体与IgG-Fc段融合基因(sc-kit-IgG-Fc),以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pIRES2-EGFP中,获得重组表达载体pIRES2-EGFP-SCF-C-Kit-IgG;采用脂质体转染技术将重组质粒转染K562细胞,用G418筛选得到稳定表达重组质粒的细胞株;多聚酶链反应(PCR)、免疫印迹(western blot)鉴定融合蛋白的表达。采用CCK-8分析法检测实验组(重组质粒转染的K562细胞组)和对照组(空载体转染的K562细胞组和单独K562细胞悬浮培养组)的K562细胞的OD值,比较不同组在不同的时间点K562细胞的增殖情况。流式细胞仪检测三组K562细胞周期的变化及其凋亡情况。结果:DNA测序证明SCF可溶性受体与IgG-Fc段连接正确,经酶切反应及多聚酶链反应(PCR)证明基因正确克隆至pIRES2-EGFP的多克隆位点,稳定转染K562细胞后应用PCR与western blot可检测到融合蛋白的表达,其分子量大小和预期的基本一致。CCK-8检测细胞周期证明:转染了重组表达载体pIRES2-EGFP-SCF-C-Kit-IgG的K562细胞与对照组(空载体转染的K562细胞组和单独K562细胞悬浮培养组)相比细胞增殖明显(p<0.01),而两对照组之间增殖无显著差异(P>0.05)。流式细胞仪检测细胞周期及凋亡发现,实验组与对照组相比S期显著升高(P<0.01),细胞凋亡率实验组明显低于对照组(p<0.01)。结论:⑴通过循环PCR技术和脂质体转染技术,成功构建了pIRES2-EGFP-SCF-C-Kit-IgG真核表达载体,并在K562细胞中表达有活性的SCF-C-Kit- IgG融合蛋白。⑵稳定转染了pIRES2-EGFP -SCF-C-Kit- IgG基因的K562细胞的增殖加快,而凋亡受到了抑制。(3)为SCF及其受体C-Kit的研究提供了细胞模型。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-7
英文缩写  7-9
研究论文 SCF 可溶性受体与IgG-Fc 段融合基因（sc-kit-IgG-Fc）真核载体的构建及在K562 细胞中的表达和作用  9-54
  前言  9-11
  材料与试剂  11-16
  实验方法  16-29
  结果  29-38
  讨论  38-45
  结论  45-46
  不足与展望  46-47
  参考文献  47-54
综述干细胞因子(SCF)的表达及其在肿瘤中的作用  54-64
  参考文献  61-64
致谢  64-65
个人简历  65

SCF可溶性受体与IgG-Fc段融合基因（sc-kit-IgG-Fc）真核表达载体的构建及在K562细胞中的表达和作用

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