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脂筏在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染中作用的初步探讨

作　者: 孙颖
导　师: 方六荣
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合症病毒脂筏胆固醇小窝蛋白-1 网格蛋白
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的传染病。它以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征。该病自1987年由美国首次报道,后迅速蔓延至世界各主要养猪国家,现已成为危害养猪业最严重的传染病之一。近几年爆发于我国的“高热病”的主要病原就包括PRRSV。研究表明,细胞膜脂质双分子层的分布是不均匀的,其中富含胆固醇和鞘脂类的微结构域可选择性地募集某些蛋白分子,具有特殊的结构组成和生物学特性,称为脂微区(lipid microdomain)。由于这些结构域在细胞膜上呈岛状分布,象是漂浮在海洋中的木筏,因此被称为脂筏(lipid raft)。脂筏参与了多种生物学过程,包括信号转导、蛋白分选、T细胞活化、细菌和病毒的侵入、病毒的装配与出芽等。脂筏中富含的胆固醇在维持脂筏的结构和细胞膜的功能等方面具有重要作用。研究表明囊膜病毒侵入宿主细胞的过程依赖于脂筏及其中的胆固醇,并且大多数病毒在出芽过程中也利用了脂筏,并以此获得细胞来源的脂质双层。但脂筏在PRRSV感染中的作用尚不清楚,鉴于此,本研究开展了构成脂筏的胆固醇及特异性蛋白质在PRRSV感染MARC-145细胞中的作用研究。主要研究内容如下:1.甲基-β-环糊精(MβCD)对MARC-145细胞的作用MβCD为胆固醇萃取剂,可以去除细胞膜中的胆固醇,利用不同浓度的MβCD处理MARC-145,结果发现在10mM以内MβCD对MARC-145细胞膜胆固醇的去除呈剂量依赖性,MβCD浓度的进一步提高其萃取作用并没有明显的增强,并且10mM MβCD可以使胞膜中胆固醇降低75%,但对细胞活性不产生明显的影响。外源性胆固醇可以补充细胞膜中胆固醇的含量使之恢复为原含量的84%。根据这一结果在后继研究中所用MβCD浓度均为10mM。2.胆固醇在PRRSV感染MARC-145细胞中的作用利用10mM MβCD萃取MARC-145细胞膜中胆固醇及萃取后补充外源胆固醇的方法研究了胆固醇在PRRSV感染MARC-145细胞各个阶段中的作用。结果表明,细胞膜中的胆固醇在PRRSV感染MARC-145细胞的多个过程中都具有重要作用。胞膜胆固醇的缺失抑制PRRSV的增殖,其增殖量下降为对照组的0.29%;胞膜胆固醇含量与病毒侵入细胞的能力成正比,并且这种相关性主要表现于病毒与细胞膜的吸附过程,流式细胞计数结果显示,对照组细胞表面吸附的病毒量为缺失胆固醇组的3.8倍;另外,胞膜胆固醇的缺失使病毒从细胞中释放的能力增强了1.06～4.92倍,但所释放的病毒粒子感染力明显降低,仅为对照组的10%。而上述所有影响都可以通过补充外源胆固醇而得到一定程度的恢复。3.脂筏及其中的标志性蛋白在PRRSV侵入MARC-145细胞过程中的作用用针对性抑制脂筏介导的胞吞途径的药物(Nystatin)处理细胞,研究脂筏在PRRSV侵入MARC-145细胞过程中的作用,结果当脂筏介导的胞吞途径被抑制时,病毒增殖能力下降为对照组的0.18%。进而,将构建的表达小窝蛋白-1基因(cav-1)及其截短片段(cav-1-Δ1-81)的真核质粒pEGFP-cav-1、pEGFP-cav-1-Δ1-81分别转染MARC-145细胞后检测其对PRRSV感染的影响,结果显示小窝蛋白-1作用的缺失对PRRSV感染的抑制作用并不显著。由此,我们再用针对性抑制网格蛋白介导的胞吞途径的药物(CPZ)处理细胞,结果PRRSV的感染受到明显的抑制,PRRSV在CPZ作用的细胞中增殖量下降为对照组的0.17%。这些结果说明PRRSV侵入MARC-145细胞的胞吞途径是依赖脂筏和网格蛋白的。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略语表(Abbreviation)  10-13
1 文献综述  13-31
  1.1 PRRSV的研究进展  13-25
    1.1.1 PRRSV的病原特征  13-15
    1.1.2 PRRSV的分子生物学特征  15-23
    1.1.3 PRRSV的感染与防治  23-25
  1.2 脂筏的构成及生物学功能  25-31
    1.2.1 脂筏的结构及特性  25-27
    1.2.2 脂筏的种类  27
    1.2.3 脂筏的功能  27-29
    1.2.4 脂筏在微生物感染中的作用  29-31
2 研究目的与意义  31-32
3 材料与方法  32-47
  3.1 试验材料  32-34
    3.1.1 细胞、毒株  32
    3.1.2 引物  32
    3.1.3 主要试剂  32
    3.1.4 培养基及主要试剂的配制  32-33
    3.1.5 主要缓冲液与相关试剂及其配制  33-34
  3.2 试验方法  34-47
    3.2.1 病毒的培养与收集  34-35
    3.2.2 半数细胞培养物感染量(TCID50)的测定  35
    3.2.3 病毒纯化及检测  35
    3.2.4 生物素标记病毒  35-36
    3.2.5 甲基-β-环糊精对MARC-145细胞的毒性测定  36
    3.2.6 细胞膜中胆固醇的去除  36
    3.2.7 细胞膜中胆固醇的补充  36-37
    3.2.8 细胞膜中胆固醇含量的测定  37
    3.2.9 RNA提取  37-38
    3.2.10 逆转录PCR  38
    3.2.11 实时荧光定量PCR  38-39
    3.2.12 流式细胞计数  39
    3.2.13 共聚焦显微技术  39
    3.2.14 病毒穿透细胞  39-40
    3.2.15 病毒侵入试验  40
    3.2.16 病毒释放试验  40
    3.2.17 脂筏与病毒增殖相关性试验  40
    3.2.18 目的外源基因的PCR扩增  40-41
    3.2.19 限制性内切酶酶切反应  41
    3.2.20 PCR产物或酶切产物的电泳检测  41
    3.2.21 PCR产物或酶切产物回收与纯化  41-42
    3.2.22 外源DNA片段与质粒载体的连接反应  42
    3.2.23 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)  42-43
    3.2.24 连接产物的转化  43
    3.2.25 质粒的小量制备  43
    3.2.26 质粒的大量制备  43-44
    3.2.27 质粒DNA的定量  44-45
    3.2.28 重组质粒(阳性质粒)的鉴定  45
    3.2.29 质粒转染(脂质体介导转染法)  45
    3.2.30 SDS-PAGE电泳  45-46
    3.2.31 统计学方法  46-47
4 结果与分析  47-58
  4.1 脂筏在PRRSV感染中的作用  47
  4.2 细胞膜中胆固醇在PRRSV感染中的作用研究  47-54
    4.2.1 MβCD处理对MARC-145细胞的毒性检测  47-48
    4.2.2 MβCD萃取MARC-145细胞膜胆固醇的能力检测  48
    4.2.3 细胞膜中胆固醇缺失抑制PRRSV感染  48-51
    4.2.4 细胞膜中胆固醇缺失减弱PRRSV侵入细胞的能力  51-53
    4.2.5 细胞膜中胆固醇缺失增强PRRSV释放能力但降低病毒感染力  53-54
  4.3 与PRRSV胞吞过程相关蛋白的研究  54-58
    4.3.1 真核表达质粒的构建与鉴定  54-55
    4.3.2 小窝蛋白-1对PRRSV感染的作用不显著  55
    4.3.3 网格蛋白(clathrin)可影响PRRSV感染  55-58
5 讨论与结论  58-63
  5.1 讨论  58-61
    5.1.1 细胞膜中胆固醇对PRRSV侵入细胞的影响  58-59
    5.1.2 细胞膜中胆固醇对PRRSV释放的影响  59
    5.1.3 细胞膜中胆固醇对PRRSV粒子感染力的影响  59-60
    5.1.4 细胞膜中胆固醇对PRRSV感染MARC-145细胞的影响  60
    5.1.5 PRRSV侵入MARC-145细胞的胞吞途径  60-61
    5.1.6 脂筏在PRRSV感染MARC-145细胞中的作用  61
  5.2 结论  61-63
参考文献  63-76
致谢  76-77
附录  77

脂筏在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染中作用的初步探讨

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