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NYD-SP15的亚细胞定位和对细胞增殖的影响

作　者: 王云
导　师: 李建民
学　校: 南京医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 胞苷脱氨酶 NYD-SP15 二聚化 亚细胞定位 细胞增殖
分类号: Q26
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


背景&目的：胞苷脱氨酶家族蛋白的功能复杂多样,许多成员与机体免疫、病毒感染、肿瘤发生和肿瘤耐药等关系密切。NYD-SP15是我们发现的该家族的新成员,对其功能的研究具有开创性的意义。本研究通过对NYD-SP15生物学活性、亚细胞定位、细胞及组织的表达分布和对细胞增殖影响等研究,初步阐明NYD-SP15基因的功能。方法：通过生物信息学软件分析比较NYD-SP15与其同家族蛋白序列的相似性,分析功能结构域,推测其功能；原核表达并纯化NYD-SP15蛋白,制备多克隆抗体,通过免疫组织化学方法分析NYD-SP15在睾丸、乳腺癌中的表达分布；通过RT-PCR分析NYD-SP15在某些正常细胞和肿瘤细胞中的表达；通过构建NYD-SP15及其核定位信号突变体的绿色荧光融合蛋白质粒,分析其在细胞内的定位和可能的核定位序列；通过酵母双杂交和GST-pulldown试验分析NYD-SP15的同源二聚化作用及NYD-SP15与入核蛋白受体importins的相互作用；构建NYD-SP15野生型及与活性位点突变质粒,流式细胞仪检测转染后对RPE细胞周期的影响,研究NYD-SP15活性位点；构建HEK-TER和MCF7细胞的NYD-SP15慢病毒稳定表达细胞株,通过划线实验和细胞生长曲线分析NYD-SP15在细胞迁移和细胞增殖中的作用,并通过流式细胞仪检测细胞周期。结果：NYD-SP15在不同的物种中具有高度的保守性,其胞苷脱氨酶结构域与DCTD最为相似且具有所有胞苷脱氨酶高度保守的HXE...PCXXC序列,且存在入核信号序列、出核信号序列和亮氨酸拉链序列。NYD-SP15在成熟的小鼠睾丸中高表达但在间质、精母细胞和精子中低表达或无表达；在所有的乳腺癌组织芯片标本中高表达。RT-PCR发现NYD-SP15在Hela、293T、MCF7、HEKTER等培养的细胞中均有表达。NYD-SP15可定位在细胞的胞核和/或胞浆,比例在不同的细胞中有所不同,在MCF7和CHO中胞核和胞浆均有分布,HEK-TER中以胞核为主,293T中以胞浆为主。删去核定位信号的NYD-SP15定位于胞浆,而其核定位信号GFP融合蛋白则只在胞核表达。通过核定位信号突变证实在NYD-SP15中确实存在双位点入核信号序列,酵母双杂交证实NYD-SP15可以与入核蛋白受体importin a相互作用。酵母双杂交和GST-pulldown证实NYD-SP15可以在体外形成同源二聚体。野生型NYD-SP15对RPE细胞的细胞周期从G1期进入S期有一定的阻滞作用,前面脱氨酶结构域的活性位点突变对这种作用有显著影响。而且稳定转染细胞株细胞生长曲线测定、划线实验和细胞周期测定也均呈现对HEK-TER和MCF7细胞生长显著的抑制作用。另外,稳定转染细胞株HEK-TER的形态学也发生了变化,细胞较对照扁平且体积变大,细胞浆内出现了很多大小不等的空泡。结论：NYD-SP15存在与其同源蛋白类似的浆/核穿梭调控机制和活性位点及二聚化效应；保守活性位点对NYD-SP15的功能是必要的；NYD-SP15与精子发生和肿瘤发生存在一定关系；对细胞生长和调控有一定影响。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-8
引言  8-11
材料和方法  11-25
结果  25-44
讨论  44-48
结论  48-49
参考文献  49-52
文献综述  52-66
  参考文献  61-66
硕士研究生期间所发表文章  66-67
致谢  67

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中图分类: > 生物科学 > 细胞生物学 > 细胞生物化学
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