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用于小分子化合物筛选的细胞模型的建立与鉴定

作　者: 肖鹤
导　师: 黎燕
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 分子免疫学
关键词: 小分子化合物细胞模型初步筛选 FK506 FKBP12/Bax双聚 CD4 细胞黏附二聚化或寡聚化调控表达 NEAT信号转导竞争抑制
分类号: R965
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

随着分子生物学技术与生物信息学技术的迅速发展和学科融合,基于生物大分子功能域的药物设计加快了有机小分子化合物成为更具有靶向、特异、高效、稳定性治疗性药物的速度。但如何快速、准确地筛选出特异性作用于生物大分子靶功能域的小分子化合物并验证它们所介导的生物效应,是有机小分子化合物作为新药研制中所急待解决的关键问题。因此,建立高效和特异的用于小分子药物筛选的细胞模型对于靶向特异新药的研制及它们所介导的生物效应机理探讨有着重要的意义。本研究基于FK506的促神经再生和免疫抑制功能域的晶体结构的生物信息数据及免疫分子CD4的功能结构域的晶体结构及其所介导免疫应答效应,应用分子生物学、细胞生物学等方法建立并验证了靶向FKBP12、NFAT信号通路以及CD4二聚化位点D1或D4结构域的高通量药物筛选的细胞模型,并对靶向于FKBP12的FK506类促神经再生小分子化合物以及靶向于CD4 D1结构域的CD4拮抗类小分子化合物进行了初步筛选和探索。本研究主要分为两大部分。一、用于FK506类小分子化合物筛选的细胞模型的建立与鉴定 1 靶向FKBP12的FK506类促损伤神经再生小分子化合物筛选的细胞模型的建立与鉴定利用RT-PCR扩增鼠源性BAX全长基因,插入PUC18载体进行测序鉴定。将鉴定正确的mBAX插入载体pC4FV1E中,构建pC4FV1E/BAX表达质粒。将表达质粒与pCDNA3.1共转染HEK293细胞,建立pC4FV1E/BAX-neo、和neo基因稳定表达的细胞模型。利用形态学方法、流式细胞术等对化学药物诱导FKBP12/BAX双聚介导的细胞凋亡进行定性及定量的分析。分别利用RT-PCR以及Western-blotting方法从mRNA及蛋白水平检测到FKBP12-mBAX融合基因的整合及表达;阳性化合物AP20187作用4-6hr后,Giemsa染色可见明显的凋亡小体;钙依赖核酸内切酶亦被激活,出现典型的“DNA Ladder”;天然产物FK506可竞争性地抑制这种阳性药物诱导的细胞凋亡。上述结果表明,所构建的FKBP12/BAX双聚体可诱导细胞凋亡生物

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-12
前言  12-19
第一部分用于FK506类小分子化合物筛选的细胞模型的建立与鉴定  19-41
  (一) 靶向FKBP12的FK506类促损伤神经再生小分子化合物筛选的细胞模型的建立与鉴定  19-30
    1.1 材料与方法  19-21
    1.2 结果  21-27
    1.3 讨论  27-30
  (二) 靶向NFAT信号途径的FK506类免疫抑制小分子化合物筛选的细胞模型的建立与鉴定  30-41
    2.1 材料与方法  30-35
    2.2 结果  35-39
    2.3 讨论  39-41
第二部分用于CD4拮抗类小分子化合物筛选的细胞模型的建立与鉴定  41-68
  (一) 基于CD4及MHC-Ⅱ类分子之间相互作用的细胞黏附模型的建立与鉴定  41-49
    1.1 材料与方法  41-43
    1.2 结果  43-47
    1.3 讨论  47-49
  (二) DOX调控CD4表达诱导细胞凋亡模型的建立  49-68
    Ⅰ.CD4同源二聚化或寡聚化的间接检测及其介导的生物学功能的初步分析  49-59
      1.1 材料与方法  49-52
      1.2 结果  52-56
      1.3 讨论  56-59
    Ⅱ.靶向CD4二聚化位点的CD4拮抗类小分子化合物筛选的细胞模型的建立  59-68
      2.1 材料与方法  59-61
      2.2 结果  61-66
      2.3 讨论  66-68
结论  68-71
参考文献  71-75
文献综述  75-86
致谢  86-88
附录Ⅰ 缩写词表  88-90
附录Ⅱ 发表文章  90

用于小分子化合物筛选的细胞模型的建立与鉴定

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