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根癌农杆菌介导的小麦全蚀菌的遗传转化

作　者: 朱琳
导　师: 康振生
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 植物病理学
关键词: 根癌农杆菌介导的遗传转化小麦全蚀菌根癌农杆菌 T-DNA 潮霉素抗性
分类号: S435.121
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 87次
引　用: 2次
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内容摘要

由禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomyces graminis (Sacc.) von Arx and Olivier var. tritici Walker,Ggt)引起的小麦全蚀病是一种世界范围内普遍发生的重要根部病害。了解病菌的致病机理对病害的有效防治具有重要意义。然而小麦全蚀病菌与寄主互作的分子生物学研究甚少,为了从分子水平上揭示全蚀病菌的致病机理,本研究建立了根癌农杆菌介导的小麦全蚀病菌的遗传转化体系,并对转化子的性质进行了初步的研究。主要研究结果如下:1.对小麦全蚀菌转化前的培养时间、培养介质、诱导剂乙酰丁香酮(AS)的浓度、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)浓度和共培养时间等影响转化的因素进行了优化。建立的高效的农杆菌转化体系为:IM培养基中AS浓度为400μM,农杆菌诱导时间为6 h OD600=0.30,小麦全蚀菌在覆盖有玻璃纸的PDA上培养2 d,将玻璃纸转移至Co-IM上,与400μL农杆菌菌液25℃共培养4 d。采用此转化体系获得了含有潮霉素抗性的转化子。2.对随机挑取14株转化子进行了有丝分裂遗传稳定性分析。在含与不含潮霉素的PDA平板上连续培养5代后,最终有7株转化子仍然表现出潮霉素抗性。表明这7株转化子是有丝分裂稳定的。3.提取转化子的DNA,根据T-DNA上已知hph基因序列设计引物,进行PCR。结果证明转化子含有插入的T-DNA片段。4.为了进一步确定T-DNA插入整合到了小麦全蚀菌的基因组中,对7株转化子进行了Southern blot分析。结果显示7株转化子为T-DNA单拷贝整合插入。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-10
第一章文献综述  10-19
  1.1 小麦全蚀病  10-11
    1.1.1 小麦全蚀病菌  10
    1.1.2 小麦全蚀病在国内外的发生情况  10-11
    1.1.3 小麦全蚀病菌遗传转化的研究进展  11
  1.2 丝状真菌遗传转化的研究现状  11-16
    1.2.1 显微注射法  12
    1.2.2 激光微束穿孔法  12-13
    1.2.3 醋酸理法  13
    1.2.4 基因枪法  13
    1.2.5 电击法  13
    1.2.6 PEG-CaC12 法  13
    1.2.7 转座法  13-14
    1.2.8 REMI 法  14
    1.2.9 ATMT 法  14-16
  1.3 农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展  16-17
    1.3.1 根癌农杆菌生物学特性  16
    1.3.2 根癌农杆菌的转化机理  16-17
    1.3.3 根癌农杆菌介导的丝状真菌转化的特点  17
  1.4 本研究的目的意义及技术路线  17-19
    1.4.1 本研究的目的意义  17
    1.4.2 本研究的主要内容  17-18
    1.4.3 本研究的技术路线  18-19
第二章材料和方法  19-33
  2.1 材料  19-24
    2.1.1 菌株和载体  19
    2.1.2 主要仪器和试剂  19-20
    2.1.3 小麦全蚀菌转化所需的试剂和培养基的配制  20-22
    2.1.4 分子生物学检测所需试剂的配制  22-24
  2.2 方法  24-33
    2.2.1 潮霉素抑制小麦全蚀病菌生长的最佳浓度筛选  24
    2.2.2 玻璃纸、硝化纤维素膜对全蚀病菌生长的影响  24
    2.2.3 头孢霉素抑制农杆菌生长的最佳浓度筛选  24-25
    2.2.4 农杆菌介导全蚀病菌的遗传转化体系的建立  25
    2.2.5 农杆菌介导全蚀病菌的遗传转化体系的优化  25
    2.2.6 不同转化子各代的生长情况  25-26
    2.2.7 转化子的有丝分裂稳定性分析  26
    2.2.8 全蚀病菌菌丝体DNA 的提取  26
    2.2.9 载体pBIG2RHPH2-GFP-GUS 的质粒提取  26-27
    2.2.10 转化子的PCR 检测  27-29
    2.2.11 转化子的Southern 杂交  29-32
    2.2.12 转化子的荧光显微观察  32-33
第三章结果与分析  33-41
  3.1 潮霉素抑制小麦全蚀病菌生长的最佳浓度筛选  33-34
  3.2 玻璃纸、硝化纤维素膜对全蚀病菌生长的影响  34-35
  3.3 头孢霉素抑制农杆菌生长的最佳浓度筛选  35
  3.4 转化体系的优化  35
  3.5 不同转化子各代的生长情况  35-36
  3.6 转化子的有丝分裂稳定性分析  36
  3.7 野生全蚀菌和转化子DNA 的提取  36-37
  3.8 转化子中T-DNA 插入的PCR 检测  37-38
  3.9 小麦全蚀病菌转化子T-DNA 插入的Southern 杂交检测  38-40
    3.9.1 野生型全蚀菌和转化子基因组DNA 的限制性酶切  38-39
    3.9.2 转化子基因组DNA 杂交分析  39-40
  3.10 小麦全蚀病菌转化子的荧光显微观察  40-41
第四章讨论  41-43
第五章结论  43-44
参考文献  44-47
缩略语表  47-48
致谢  48-49
作者简介  49

根癌农杆菌介导的小麦全蚀菌的遗传转化

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