学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

猪羊水干细胞生物学特性检测及其特异性诱导分化研究

作　者: 卢智娟
导　师: 王华岩
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 动物生物技术
关键词: 猪羊水干细胞诱导分化心肌细胞
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 50次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载

内容摘要

羊水来源干细胞(amniotic fluid stem cells,AFScs)是一种存在于胎儿羊水中Oct4阳性的多能性干细胞。该细胞具有增殖能力强、分化潜能高和免疫原性低等优点,在生物学和医学研究领域具有广泛的应用前景。本实验从不同怀孕期长白二元杂交母猪的羊水标本中分离猪羊水干细胞,探讨了猪胎龄对细胞贴壁率和细胞活性的影响,并筛选优化了猪AFS细胞的培养体系。同时,通过RT-PCR、流式细胞仪、免疫荧光及体内外诱导分化等技术对猪AFS细胞进行生物学特性检测,并在体外特异性诱导猪AFS细胞向心肌细胞分化。上述研究为大动物羊水干细胞的基础研究和临床应用提供了可借鉴的材料。一、猪AFS细胞培养方法的建立收集长白二元杂交怀孕母猪的羊水标本,离心收集细胞,加入猪AFS细胞培养液培养。对血清浓度及基础培养液进行筛选,以期获得最佳的培养体系,并且探讨了胎龄对细胞贴壁率和细胞活性的影响。结果表明:基础培养液α-MEM+10%胎牛血清为猪AFS细胞的最佳培养体系;胎龄对细胞贴壁率和细胞活性均有明显影响,综合分析,从胎龄为40-70d的猪胎儿羊水中分离出的羊水干细胞贴壁率高,增殖能力强且细胞活性好。二、猪AFS细胞的生物学特性研究对分离培养的猪AFS细胞进行生长曲线和细胞周期检测,并通过RT-PCR、免疫荧光、流式细胞仪等技术对其生物学特性进行研究。结果表明:猪羊水干细胞在体外培养过程中,3天后达到对数增长期,6天后细胞增殖达到顶峰,表现出了极强的增殖能力;流式细胞周期检测显示处于G1期和S期的细胞比例较高,且在体外多次传代后仍保持正常的二倍体核型;猪AFS细胞表达胚胎干细胞标志基因Oct4、Nanog、SSEA-4、Tra-60、Tra-81、CD117和主要组织相容性抗原HLA-ABC,不表达SSEA-1,表达间充质特异标志基因CD44、CD90、CD166,不表达造血干细胞标志基因CD45、CD34。三、猪AFS细胞体内外诱导分化研究在体外将猪AFS细胞形成类胚体,并通过AP染色和RT-PCR对形成的类胚体进行检测;特异性诱导猪AFS细胞向脂肪细胞、神经细胞、精原细胞和心肌细胞分化,以检测其体外分化潜能;通过裸鼠注射实验检测猪AFS细胞的体内分化潜能;结果表明:猪AFS细胞在体外能形成类胚体,AP染色阳性,且表达三胚层特异标志基因;在体外猪AFS细胞可诱导为脂肪细胞、神经细胞、精原细胞和心肌细胞,经检测有目的细胞基因的表达;将猪AFS细胞注射到裸鼠皮下6-8周后,注射部位未发现肿瘤结节的形成,说明猪AFS细胞在体内无致瘤性。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-13
引言  13-14
文献综述  14-29
  第一章羊水干细胞的研究进展  14-23
    1.1 羊水干细胞的概念  14
    1.2 AFS 细胞的来源及细胞的种类  14-16
      1.2.1 上皮样细胞(E-type cells, E 细胞)  15
      1.2.2 羊水细胞(AF-type cells, AF 细胞)  15
      1.2.3 成纤维样细胞(F-type cells, F 细胞)  15-16
    1.3 AFS 细胞的分离培养和纯化方法  16-18
      1.3.1 AFS 细胞的分离培养  16
      1.3.2 AFS 细胞的纯化方法  16-18
    1.4 AFS 细胞的生物学特性  18-20
      1.4.1 AFS 细胞的形态及增殖特性  18
      1.4.2 AFS 细胞的表面标志及干细胞基因  18-20
    1.5 AFS 细胞的体外诱导分化（见第二章）  20
    1.6 AFS 细胞的体内诱导分化  20
    1.7 AFS 细胞的应用前景  20-21
      1.7.1 组织工程  20
      1.7.2 细胞治疗  20
      1.7.3 基因治疗  20-21
      1.7.4 药物筛选及发育模型的建立  21
      1.7.5 生产克隆和转基因动物  21
    1.8 AFS 细胞研究存在的问题  21-22
      1.8.1 建立高效快速大规模扩增体系  21
      1.8.2 AFS 细胞向特定功能细胞分化的问题  21-22
      1.8.3 AFS 细胞的筛选纯化问题  22
      1.8.4 AFS 细胞移植治疗的免疫排斥问题  22
    1.9 小结  22-23
  第二章羊水干细胞的体外诱导分化研究  23-29
    2.1 AFS 细胞体外诱导分化的基本原理  23
    2.2 AFS 细胞体外诱导分化的方法  23-24
      2.2.1 化学试剂诱导法  23-24
      2.2.2 细胞因子诱导法  24
      2.2.3 外源基因导入法  24
      2.2.4 条件培养液诱导或与目的细胞共培养  24
    2.3 AFS 细胞体外诱导的细胞类型  24-28
      2.3.1 肌细胞  24-25
      2.3.2 脂肪细胞  25-26
      2.3.3 神经细胞  26-27
      2.3.4 成骨细胞  27
      2.3.5 肝细胞  27-28
      2.3.6 肾脏细胞  28
      2.3.7 内皮细胞  28
      2.3.8 诱导多能干细胞（ips）  28
    2.4 AFS 细胞诱导分化展望  28-29
试验研究  29-58
  第三章猪AFS 细胞的分离培养  29-37
    3.1 材料和方法  29-32
      3.1.1 材料  29-30
      3.1.2 方法  30-32
    3.2 结果  32-35
      3.2.1 pAFS 细胞的形态  32
      3.2.2 培养基筛选结果  32-35
      3.2.3 胎龄对细胞贴壁率和细胞活性的影响  35
    3.3 讨论  35-36
    3.4 小结  36-37
  第四章猪AFS 细胞的生物学特性检测  37-49
    4.1 材料和方法  37-41
      4.1.1 材料  37-38
      4.1.2 方法  38-41
    4.2 结果  41-47
      4.2.1 猪AFS 细胞的增殖动力学  41
      4.2.2 细胞周期分析结果  41-42
      4.2.3 RT-PCR 检测结果  42-43
      4.2.4 流式细胞学检测结果  43
      4.2.5 Oct4 和Nanog 启动子检测结果  43
      4.2.6 免疫荧光结果  43-47
    4.3 讨论  47-48
    4.4 小结  48-49
  第五章猪AFS 细胞的分化潜能研究  49-58
    5.1 材料  49-50
      5.1.1 试验标本  49
      5.1.2 主要试剂  49-50
      5.1.3 主要设备和器材  50
    5.2 方法  50-52
      5.2.1 猪AFS 细胞体外诱导分化  50-52
      5.2.2 猪AFS 细胞体内诱导分化  52
    5.3 结果  52-56
      5.3.1 体外诱导分化结果  52-53
      5.3.2 体内诱导分化结果  53-56
    5.4 讨论  56-57
    5.5 小结  57-58
结论  58-59
论文创新点及进一步研究的课题  59-60
参考文献  60-66
致谢  66-67
作者简介  67

猪羊水干细胞生物学特性检测及其特异性诱导分化研究

内容摘要

全文目录

相似论文