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中国明对虾抗脂多糖因子(ALFFc)基因的重组表达

作　者: 李婷
导　师: 柳峰松
学　校: 河北大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 中国明对虾抗脂多糖因子重组表达抗血清 Western Blot
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

上世纪80年代开始,对虾养殖业得到了迅速发展,这给沿海地区带来了可观的经济效益,但同时对虾疾病也给养殖带来了很大的困扰,造成了巨大的经济损失。近年来对虾的免疫学研究得到了长足进展,不断有免疫相关基因被克隆并得以深入研究。抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharide factor,ALF)是发现于鲎和甲壳动物体内的一种重要的抗菌蛋白,具有广谱抗菌活性,对其进行深入研究将有利于对虾疾病的控制。本文以中国明对虾为材料,围绕其ALF(ALFFc)基因的重组表达展开研究,主要包括以下3个方面:1:根据中国明对虾ALFFc基因设计引物,构建了pET-DsbA-ALFFc原核表达载体,对其进行了原核表达。由于常规方法诱导ALFFc基因表达会出现宿主“自杀”现象,难以获得重组蛋白,所以本研究尝试了“低温诱导法”,“DTT诱导法”,和“IPTG筛选法”三种策略,均实现了重组蛋白的高表达。2:对上述三种诱导方法进行比较,最终选择IPTG筛选法对DsbA-ALFFc重组蛋白进行大规模诱导表达,用His亲和层析柱纯化重组蛋白后免疫新西兰大白兔,制备了抗血清。经Western Blot检测在预期位置上得到了一条特异性条带。3:构建了pPIC9K-ALFFc真核表达载体,用GS115宿主菌对ALFFc基因进行真核表达,并对发酵条件进行了摸索。用上述制备的抗血清做Western Blot检测,结果显示:在ALFFc预期位置出现了一条特异性条带,这说明成功地进行了目的蛋白的表达。4:将等量的对虾组织蛋白样品包括血细胞、血清、鳃、肠、卵巢、肝胰脏和肌肉,进行15%的SDS-PAGE电泳分离后做Western Blot检测,结果显示:ALFFc主要存在于血细胞中,肠组织中出现较弱阳性信号,而血清及其他组织未见明显阳性信号,这说明健康对虾ALFFc蛋白主要贮存于血细胞中。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
第1章文献综述  11-23
  1.1 前言  11
  1.2 甲壳动物免疫系统  11-14
    1.2.1 细胞免疫  12-13
    1.2.2 体液免疫  13-14
  1.3 抗菌肽研究进展  14-17
    1.3.1 抗菌肽的特点  14-15
    1.3.2 抗菌肽的分类  15-17
    1.3.3 抗菌肽的作用机制  17
  1.4 甲壳动物抗菌肽的研究进展  17-18
  1.5 ALF 的研究进展  18-21
  1.6 研究目的和意义  21-23
第2章中国明对虾ALFFc 基因的原核表达  23-35
  2.1 引言  23
  2.2 实验材料  23-24
    2.2.1 研究材料  23-24
    2.2.2 培养基和试剂的配制  24
  2.3 实验方法  24-26
    2.3.1 总RNA 的提取及cDNA 的合成  24-25
    2.3.2 ALFFc 基因的克隆及载体构建  25
    2.3.3 重组蛋白的诱导表达  25-26
  2.4 结果与分析  26-32
    2.4.1 ALFFc 基因片段的扩增及重组质粒的酶切鉴定  26-27
    2.4.2 重组蛋白的诱导表达  27-32
  2.5 讨论  32-35
第3章中国明对虾ALFFc 的纯化、抗血清制备及组织表达分析  35-40
  3.1 前言  35
  3.2 试剂的配制  35-36
  3.3 实验方法  36-37
    3.3.1 ALFFc 重组蛋白的纯化  36
    3.3.2 多克隆抗血清的制备  36
    3.3.3 免疫扩散法检测抗血清的产生  36
    3.3.4 融合蛋白DsbA-ALFFc 的Western Blot 鉴定  36
    3.3.5 ALFFc 在蛋白水平上的组织定位  36-37
  3.4 结果  37-39
    3.4.1 ALFFc 重组蛋白的纯化  37
    3.4.2 免疫扩散结果  37-38
    3.4.3 Western Blot 鉴定结果  38
    3.4.4 ALFFc 在蛋白水平上的组织定位  38-39
  3.5 讨论  39-40
第4 章中国明对虾ALFFc 基因的毕赤酵母表达  40-50
  4.1 前言  40
  4.2 研究材料  40-41
    4.2.1 实验材料  40
    4.2.2 培养基和试剂的配制  40-41
  4.3 实验方法  41-44
    4.3.1 总RNA 的提取及cDNA 的合成  41-42
    4.3.2 ALFFc 基因的克隆及载体构建  42
    4.3.3 质粒pPIC9K-ALFFc，pPIC9K 的提取及线性化  42
    4.3.4 毕赤酵母的转化  42-43
    4.3.5 筛选Mut~+和Muts~5转化子  43
    4.3.6 酵母DNA 的提取  43
    4.3.7 转化子的PCR 鉴定  43-44
    4.3.8 重组酵母的诱导表达  44
    4.3.9 SDS-PAGE 检测蛋白表达情况  44
    4.3.10 Western Blot 鉴定表达产物  44
  4.4 结果  44-50
    4.4.1 ALFFc 基因片段的扩增及重组质粒的酶切鉴定  44-45
    4.4.2 毕赤酵母的转化及MM，MD 筛选结果  45-46
    4.4.3 转化子的PCR 鉴定结果  46
    4.4.4 重组酵母的诱导表达  46
    4.4.5 Western Blot 鉴定结果  46-50
结论  50-51
参考文献  51-58
致谢  58-59
攻读学位期间发表的论文  59

中国明对虾抗脂多糖因子(ALFFc)基因的重组表达

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