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原发性胆汁性肝硬化患者Th17细胞体外分化诱导条件的研究

作　者: 邓日辉
导　师: 陈曲波
学　校: 广州中医药大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 原发性胆汁性肝硬化 Th17细胞 IL-17 细胞因子免疫磁珠分选技术荧光定量PCR 流式细胞术酶联免疫吸附试验
分类号: R575.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景Th17细胞是近年来发现的不同于Th1、Th2细胞的CD4+T细胞亚群,通过分泌IL-17、IL-21、IL-22等效应因子在自身免疫疾病和感染性疾病中发挥作用。原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是一类器官特异性自身免疫性肝病,发病原因不明,可能机体免疫紊乱相关。本研究拟从Th17细胞的角度对PBC进行研究,希望从中找到增强其免疫调节功能的干预措施,为临床治疗PBC提供新的策略和实验依据,具有重要意义。目的本研究拟以新近发现的以分泌IL-17为主要特征的CD4+T细胞亚群—Th17细胞为主要线索,经免疫磁珠分选技术分选出初始T(Naive T)细胞,通过加入细胞因子或细胞因子组合行体外培养,诱导其分化为Th17细胞。应用流式细胞术(FCM)、荧光定量PCR技术和酶联免疫吸附试验(ELISA)等技术评估Th17细胞的最优体外分化条件,同时比较原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者和正常人外周血Th17细胞分化条件的差异。期冀通过研究,初步建立人外周血Th17细胞体外分化诱导条件,并为进一步探索Th17细胞与PBC发病机制的相关性提供实验依据。方法1人外周血Th17细胞体外分化诱导条件的建立：采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC)；免疫磁珠分选技术(MACS)从PBMC中进一步分选初始T(Naive T)细胞。将Naive T细胞以1×109／L的密度分4组培养在48孔培养板中,每组设2个复孔,每孔500ul,培养第1天起在各孔均加入anti-CD3、anti-CD28和anti-IL-4、anti-IFN-γ作为基础培养剂后,4组再各自加入不同的细胞因子进行诱导培养：(1)不加任何细胞因子为空白对照组；(2)IL-1β组；(3)IL-1β+IL-6组；(4)IL-1β+IL-6+IL-23组于37℃、5%CO2孵箱中进行细胞培养,每3天换液一次,并及时补充相应的细胞因子。培养9天后在PMA、Ionomycin与monensin的刺激下继续培养4小时,收集培养后的细胞,经流式细胞术评估Th17细胞最佳分化效果。2 PBC患者和正常人外周血Th17细胞分化效果差异的观察：(1)Ficoll-Hypaque密度梯度离心法及免疫磁珠分选技术(MACS)从PBC患者和正常人外周血中分选Naive T细胞,各自按上述条件进行细胞培养。(2)培养72小时收集细胞上清液-80℃迅速冻存,用于IL-17的ELISA检测。(3)细胞培养时每3天换液一次,并及时补充相应的细胞因子,培养9天后在PMA、Ionomycin与monensin的刺激下继续培养4小时。(4)收集培养的细胞洗涤离心,弃上清液,迅速加入Trizol液,提取RNA逆转录成cDNA,经荧光定量PCR检测IL-17mRNA基因的表达量。(5)统计分析并比较PBC患者组与正常人组胞外IL-17含量及胞内IL-17mRNA表达差异,间接分析两组Th17细胞分化效果的差异。结果1流式细胞术检测结果与正常人比较,PBC患者IL-1β+IL-6+IL-23组诱导Naive T细胞分化为Th17细胞频率最高,两者有显著性差异(P<0.01)。对于PBC患者本身,IL-1β组；IL-1β+IL-6组；IL-1β+IL-6+IL-23组均能显著诱导Th17细胞分化(P<0.01)；但IL-1β+IL-6+IL-23组Th17细胞分化频率最高,显著高于其它各组(P<0.01)。2 ELISA检测结果收集细胞培养上清液经ELISA检测表明：与正常人比较,PBC患者IL-1β+IL-6+IL-23组培养上清液中IL-17浓度更高,两者有统计学差异(P<0.05)。3荧光定量PCR检测结果IL-1β+IL-6+IL-23联用时,PBC患者外周血Naive T细胞经培养9天后,经荧光定量PCR检测：IL-17mRNA基因表达率是正常人的3.73倍,且两者有显著性差异(P<0.01)。结论1 IL-1β、IL-6、IL-23单独或联用均能诱导PBC患者Th17细胞分化,且IL-1β、IL-6、IL-23联用时其效果明显高于正常人。联用IL-1β、IL-6、IL-23时可使PBC患者Th17细胞体外分化效率达到最佳。2 IL-1β、IL-6、IL-23联用能有效诱导PBC患者和正常人Naive T向Th17细胞分化,且两者分化效果差异显著,表明Th17细胞体外分化差异可能与其来源有关。

全文目录

中文摘要  3-5
Abstract  5-9
引言  9-11
第一部分原发性胆汁性肝硬化患者Th17体外分化诱导条件的建立  11-22
  材料  11-12
  方法  12-15
    1 外周血单个核细胞(PBMC)的获取  12-13
    2 NaiveT细胞分选  13
    3 细胞培养  13-14
    4 流式细胞术检测  14
    5 统计学分析  14-15
  结果  15-19
  讨论  19-22
第二部分 PBC患者和正常人Th17细胞体外分化效果差异比较  22-32
  材料  22-23
  方法  23-27
    1 荧光定量PCR技术检测IL-71基因的表达  23-26
    2 ELSIA检测上清液LI-71的含量  26-27
    3 统计学分析  27
  结果  27-30
  讨论  30-32
结语  32-33
参考文献  33-38
附录  38-40
  附录一缩略语  38-39
  附录二主要生化试剂及配制  39-40
研究生在学期间发表论文情况  40-41
致谢  41

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