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蛋氨酸裂解酶的基因克隆及表达

作　者: 夏立亮
导　师: 毛亚杰；于源华
学　校: 长春理工大学
专　业: 生物医学工程
关键词: L-蛋氨酸γ-裂解酶抗癌剂同型半胱氨酸血症阴道毛滴虫基因克隆
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

L-蛋氨酸γ-裂解酶（MGL）能催化L-蛋氨酸及同型半胱氨酸的α,γ-裂解反应,被应用于肿瘤治疗及同型半胱氨酸血症的诊断。本文实现了阴道毛滴虫蛋氨酸γ-裂解酶基因克隆与表达,并对重组酶的性质进行探索。从阴道毛滴虫中提取RNA,经过逆转录PCR克隆蛋氨酸γ-裂解酶基因,与pET-15b质粒连接构建出原核表达载体pET-15b-mgl1并进行测序。经IPTG诱导重组蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达。对表达条件优化,确定最佳条件是:培养基pH5.0,培养温度27℃,诱导时菌体浓度OD₆₀₀为0.6,诱导剂IPTG的终浓度为0.6mM,诱导时间为5小时。用镍柱对重组蛋白进行纯化,并免疫小鼠,Western blot显示小鼠血清抗体可以与从阴道毛滴虫提取的MGL结合,证明所表达的重组蛋白具有生物活性。活性测定显示可溶性MGL具有较高活性,每升发酵菌液可以制备6.58毫克可溶性MGL,纯化回收率达到41.1%。分别以L-蛋氨酸、D L-同型半胱氨酸、L-半胱氨酸为底物测定重组酶Km值为0.318mM,2.14mM,1.62mM,比活性分别为20.17,318.69,56.96umol/min/mg protein。MGL最适pH在5.0到6.0之间,在50℃可稳定30分钟。重组酶具有较高的活性和较好的热稳定性,为临床应用奠定基础。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-7
目录  7-8
第一章绪论  8-18
  1.1 引言  8
  1.2 蛋氨酸裂解酶的研究进展  8-17
  1.3 论文研究目的和意义  17-18
第二章重组表达载体PET-15B-MGL1的构建  18-32
  2.1 实验材料  18-19
  2.2 实验内容  19-25
  2.3 实验结果  25-28
  2.4 结果讨论  28-32
第三章蛋氨酸裂解酶在E.COLI中的表达及条件优化  32-46
  3.1 实验材料  32-33
  3.2 实验内容  33-37
  3.3 实验结果  37-43
  3.4 结果讨论  43-46
第四章蛋氨酸裂解酶的纯化及酶学性质测定  46-65
  4.1 实验材料  46-48
  4.2 实验内容  48-52
  4.3 实验结果  52-58
  4.4 结果讨论  58-65
结论  65-66
致谢  66-67
参考文献  67-70

蛋氨酸裂解酶的基因克隆及表达

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