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水稻齿叶矮缩病毒Pns10的定位及其自身互作研究

作　者: 韩召
导　师: 吴祖建；魏太云
学　校: 福建农林大学
专　业: 微生物学
关键词: RRSV Pns10 免疫荧光酵母双杂交技术免疫共沉淀
分类号: S435.111.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)水稻病毒属(Oryzavirus)的典型成员。RRSV基因组由10条dsRNA组成(S1-S10),编码11种蛋白质(S4编码2种蛋白),其中包括8种结构蛋白和3个非结构蛋白(Pns6、Pns7和Pns10)。该病毒引起的水稻齿叶矮缩病在东南亚、东亚和南亚的一些国家局部地区发生,给当地的水稻生产带来很大的损失。本文通过直接荧光观察和免疫荧光技术研究了RRSV Pns10及其缺失N端10个氨基酸的突变体Pns10△N和缺失C端10个氨基酸的突变体Pns10△C在昆虫细胞中的定位情况。结果发现,完整的Pns10及其N端和C端缺失突变体在Sf9细胞中都能形成类似于viroplasm基质的内含体。缺失N端10个氨基酸的突变体形成的内含体要比完整Pns10形成的内含体要大,在细胞中的分布比完整Pns10形成的内含体分布更为弥散。缺失C端10个氨基酸的缺失突变体形成的内含体在大小和数量上都与完整的完整Pns10形成的内含体没有明显差异。通过酵母双杂交技术和免疫共沉淀技术对Pns10、Pns10△N和Pns10△C的自身互作进行了研究。结果表明Pns10能自身互作,Pns10△N和Pns10△C则不能自身互作,这说明Pns10具有自身互作的功能,并且该蛋白的N端10个氨基酸和C端10个氨基酸是Pns10的自身互作必需的。通过实验得知RRSV Pns10定位在细胞质,具有自我互作的能力。已有报道表明Pns10还具有ATPase活性。因此Pns10很可能是组成病毒原质的成份,并在病毒的装配中起作用。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-9
1 前言  9-23
  1.1 齿叶矮缩病毒研究进展  9-16
    1.1.1 齿叶矮缩病的发生及危害  9
    1.1.2 水稻齿叶矮缩病的症状  9
    1.1.3 RRSV 的寄主范围和传播介体  9-10
    1.1.4 RRSV 的粒子特性  10-11
    1.1.5 RRSV 的基因组结构  11-12
    1.1.6 RRSV 编码蛋白的功能  12-15
    1.1.7 RRSV 的防治  15-16
  1.2 研究中用到的实验技术和系统  16-21
    1.2.1 免疫荧光技术（immunofluorescent technique）  16
    1.2.2 酵母双杂交技术  16-17
    1.2.3 The DUALmembrane system  17-19
    1.2.4 Bac-to-Bac 表达系统  19-20
    1.2.5 Strep-tag(?) 纯化系统  20
    1.2.6 免疫共沉淀技术  20-21
  1.3 本项目研究的目的及意义  21-23
2 RRSV-Pns10 蛋白及其缺失突变体在 Sf9 细胞中的表达与定位研究  23-37
  1 材料与方法  23-31
    1.1 材料  23-25
    1.2 方法  25-31
  2 结果与分析  31-35
    2.1 RRSV 基因组S10 片段克隆  31
    2.2 重组杆状病毒转移载体的构建  31-32
    2.3 重组Bacmid 的提取与鉴定  32-33
    2.4 昆虫细胞转染  33
    2.5 细胞的荧光观察  33-35
  3 小结与讨论  35-37
3 免疫荧光技术研究 RRSV-Pns10 的定位情况  37-50
  1 材料与方法  37-42
    1.1 材料  37-38
    1.2 方法  38-42
  2 结果与分析  42-48
    2.1 dsRNA 的提取  42
    2.2 目的基因的扩增  42-43
    2.3 重组杆状病毒转移载体的构建  43-44
    2.4 重组Bacmid 的提取与鉴定  44-45
    2.5 重组Bacmid 转染昆虫细胞  45-46
    2.6 重组蛋白的表达与Western blot 检测  46
    2.7 免疫荧光技术观察蛋白的定位  46-48
  3 小结与讨论  48-50
4 酵母双杂交研究 RRSV-Pns10 蛋白及其缺失突变体的自身互作情况  50-58
  1 材料与方法  50-53
    1.1 材料  50-51
    1.2 方法  51-53
  2 结果与分析  53-57
    2.1 目的基因的扩增  53-54
    2.2 酵母表达载体的构建  54-55
    2.3 酵母双杂交验证蛋白之间的互作  55-56
    2.4 β-半乳糖苷酶活性分析  56-57
  3 小结与讨论  57-58
5 免疫共沉淀研究 RRSV-Pns10 蛋白及其缺失突变体的自身互作情况  58-69
  1 材料与方法  58-64
    1.1 材料  58-60
    1.2 方法  60-64
  2 结果与分析  64-67
    2.1 目的基因的扩增  64
    2.2 烟草瞬时表达载体的构建  64-65
    2.3 重组质粒转化农杆菌EHA105  65-66
    2.4 免疫共沉淀验证蛋白间的互作  66-67
  3 小结与讨论  67-69
6 总结与展望  69-72
参考文献  72-78
致谢  78

水稻齿叶矮缩病毒Pns10的定位及其自身互作研究

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