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血管新生对新生大鼠脑室下区神经干细胞增殖分化的影响

作　者: 沙彬
导　师: 周文浩
学　校: 复旦大学
专　业: 儿科学
关键词: 神经干细胞 神经再生 血管新生 血管内皮细胞生长因子 脑室下区
分类号: R722.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


【研究目的】早产儿大脑处于发育未成熟阶段,如何充分利用早产儿大脑可塑性极强的特点,激活内源性神经干细胞修复,已成为早产儿脑损伤治疗策略中最具潜能的发展方向。促进神经干细胞发生增殖分化的原因主要在于其微环境的改变,调控神经干细胞微环境可以改变神经干细胞的增殖、迁移、分化,而新生血管可能是神经再生的基础和微环境的主要决定者。基于VEGF联系血管新生和神经再生特征,我们设想血管内皮细胞可能在调控神经干细胞微环境的关键组成,血管新生可能和神经再生存在着必然的联系。为了研究血管新生对未成熟脑内源性神经干细胞激活的影响,本研究运用腺病毒基因转染和siRNA技术进行体内转染,对VEGF进行knock-in和knock-down后,观察血管新生增生或受抑时,脑室下区(subventricular zone,SVZ)区神经干细胞增殖分化的变化。【研究方法】构建VEGF腺病毒载体(Ad5-VEGF165-mCMV-EGFP),制备筛选VEGF小干扰RNA(small interference RNA,siRNA);采用3日龄新生大鼠,进行侧脑室注射,诱导高表达及低表达VEGF;用实时荧光定量PCR(real-timePCR)、免疫印迹(Western-blot)、免疫组化等技术检测VEGF表达水平;观察各组大鼠不同时间点脑室下区新生血管的增生、神经干细胞增殖及其向神经元系及胶质细胞系分化状况,分析两者相关性。【研究结果】(1)通过体内转染可成功对脑室下区的VEGF表达进行knock-in和knock-down:侧脑室注射VEGF腺病毒载体及VEGF-siRNA,脑室下区VEGF基因及蛋白水平相应上调或下调,VEGF基因在7d时间点时各组间表达有明显统计学差异,VEGF腺病毒载体注射组VEGF水平明显升高,VEGF-siRNA组明显降低。(2)脑室下区血管新生相应VEGF水平受到促进或抑制,脑室下区血管新生与神经干细胞增殖分化有时空同步性:免疫荧光标记研究显示,转染后7d时间点,血管标记物(vWF)标记阳性面积各组间有明显统计学差异,随着VEGF水平上调血管新生被促进,而VEGF水平下调血管新生被抑制;脑室下区免疫荧光双标记表明,vWF阳性细胞与Nestin阳性细胞数各组间有明显差异,VEGF高表达组vWF阳性面积与Nestin阳性细胞数均明显升高,而VEGF低表达组vWF阳性面积与Nestin阳性细胞数均明显降低,且Nestin阳性细胞在空间上紧紧围绕于vWF阳性细胞分布。(3)脑室下区神经干细胞增殖分化相应血管新生情况受到促进或抑制:real-time PCR、Wesern blot及免疫荧光标记等研究结果表明,在转染后7d时间点,Nestin mRNA及蛋白水平各组间有明显统计学差异,VEGF高表达组明显升高,而VEGF低表达组明显降低;脑室下区Nestin单标及Nestin与PCNA双标细胞数各组间有明显统计学差异,VEGF高表达组单标及双标细胞均明显升高,而VEGF低表达组单标及双标细胞均明显降低;在转染后7d时间点,Tui1、GFAP及NG2 mRNA水平各组间有明显统计学差异,VEGF高表达组明显升高,而VEGF低表达组明显降低;脑室下区Map2、GFAP及O4单标及Map2、GFAP及O4与PCNA双标细胞数各组间均有明显统计学差异,VEGF上调组单标及双标细胞均明显升高,而VEGF下调组单标及双标细胞均明显降低。(4)皮层中各类神经细胞分化相应血管新生情况受到促进或抑制:免疫荧光Map-2、GFAP、O4单标记显示,于7d时间点,VEGF高表达组Map-2阳性细胞数、GFAP阳性细胞数及O4阳性细胞数均增加,差异有统计学意义,VEGF低表达组与对照组相比各类细胞数均减少,差异有统计学意义。【结论】(1)SVZ区血管新生和神经细胞的增多时相性是同步的,且神经干细胞围绕于血管周围分布,提示了血管新生与神经再生的相关性。(2)血管新生促进神经干细胞增殖、向功能细胞的分化以及向皮层的迁移,相反,血管新生受抑可抑制神经干细胞增殖、分化和迁移。本研究为血管新生调控神经干细胞增殖分化观点提供重要理论依据,可通过促进血管新生激活内源性神经干细胞,为发育期脑损伤的干预提供新的思路。

全文目录


缩略词表  4-5
中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
前言  9-11
正文  11-48
  第一部分 VEGF腺病毒载体构建及VEGF-siRNA制备筛选  11-29
    材料和方法  11-25
    结果  25-26
    讨论  26-28
    结论  28-29
  第二部分 血管新生对新生大鼠脑室下区神经干细胞增殖分化的影响  29-48
    材料和方法  29-34
    结果  34-44
    讨论  44-47
    结论  47-48
参考文献  48-53
综述  53-64
后记  64-65
  致谢  64-65
硕士研究生在读期间发表论文  65-66

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