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兔眼移植重组人Ⅲ型胶原基组织工程角膜的实验研究

作　者: 戎慧丰
导　师: 颜华
学　校: 天津医科大学
专　业: 眼科学
关键词: 角膜移植角膜替代物神经生长因子生物相容性神经再生
分类号: R779.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：1.体外构建重组人Ⅲ型胶原(recombinant human type-Ⅲcollagen, RHC-Ⅲ)/聚[3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺](poly [(3-(methacryloylamino) propyl) dimethyl (3-sulfopropyl) ammonium hydroxide]) (PMPDSAH)互穿聚合物网络(interpenetrating polymer network, IPN) (RHC-Ⅲ/PMPDSAH IPN)水凝胶,并检测其生物和力学性能。2.评价RHC-Ⅲ/PMPDSAH IPN水凝胶板层植入兔角膜的生物相容性及其作为角膜替代物的可行性和安全性。3.评价神经生长因子(never growth factor, NGF)对兔角膜板层移植术后创伤修复的作用以及负载NGF到RHC-Ⅲ/PMPDSAH IPN水凝胶中方法的可行性和有效性。方法：1.将10%RHC-Ⅲ溶液与3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺(3-(methacryloylamino) propyl) dimethyl (3-sulfopropyl) ammonium hydroxide (MPDSAH)水溶液(与胶原质量比1：1)在0℃下混匀后加入交联剂等,反应后放入模具中,经固定、固化、熟化、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)液浸泡和换液后,4℃下保存备用。(由天津大学材料科学与工程学院完成)2.将制作好的RHC-Ⅲ/PMPDSAH IPN水凝胶冻干后,浸入500μl浓度为30μg/ml的NGF-牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA) (NGF:BSA质量比为1：300)溶液中,4℃下平衡3～4天,用PBS液洗材料,冻干后4℃下保存备用。(由天津大学材料科学与工程学院完成)3.105只中国大耳白兔根据角膜材料不同随机分为3组：RHC-Ⅲ/PMPDSAH IPN组(A组,30只)、负载NGF的RHC-Ⅲ/PMPDSAH IPN组(B组,30只)和同种异体角膜组(C组,30只),剩余15只(30眼)为C组提供供体角膜。每组再根据不同的观察时间点分为术后3天、1周、2周、1个月、3个月和6个月亚组,每组5只,右眼为手术眼。将3种材料移植入兔角膜前板层,术后裂隙灯观察有无明显炎症反应,记录角膜透明度、角膜新生血管(neovascularization, NV)的变化情况以及角膜上皮化时间,并分别于各时间点取兔角膜行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining, HE)染色,术后6个月行角膜透光率检测,免疫组织化学染色检测角膜上皮细胞特异性标志蛋白K3抗体AE5的表达。对3组间角膜上皮化时间、各对应时间点角膜透明度和NV评分以及术后6个月角膜透光率进行统计学比较,以P<0.05作为差异有统计学意义。4.24只中国大耳白兔随机分为A组和B组,每组12只,再根据不同观察时间点分为术后2周、1个月、3个月和6个月亚组,每组3只,右眼为手术眼。A组兔角膜前板层植入负载5ng/mg NGF的RHC-Ⅲ/PMPDSAH IPN, B组植入不含NGF的RHC-Ⅲ/PMPDSAH IPN。两组各时间点取兔眼做角膜神经氯化金染色,另取A组术后6个月亚组处死的3只兔对侧眼作为正常对照,光镜下观察两组各时间点以及正常对照眼角膜神经修复情况并计算上皮及浅基质层神经纤维数量,以P<0.05作为差异有统计学意义。结果：1.材料直径12 mm,厚度200μm,曲率半径7.25 mm,凝胶平衡含水量为(90.2±0.7)%,白光透过率达(89±1)%,折光指数为1.35,抗张强度(0.56±0.41)MPa。负载NGF的RHC-Ⅲ/PMPDSAH IPN性能与RHC-Ⅲ/PMPDSAH IPN基本相同,NGF在凝胶中的载药量为5ng/mg,包封率为10.2%。(由天津大学材料科学与工程学院完成)2.整个观察期间,纳入实验的植片均未脱出,未见明显排斥反应。术后6个月,3组角膜透明度和NV评分以及角膜透光率比较差异均无统计学意义(F0.07,F=0.07,F=1.48,P>0.05)。B组角膜上皮化时间最短,平均5.00±0.59天,3组比较差异有统计学意义(F=57.99,P<0.05)。HE染色可见A、B组材料能较好地与兔角膜融合,使上皮长入,术后6个月新生胶原纤维排列基本整齐,免疫组化显示角膜上皮细胞特异性标志蛋白K3抗体AE5表达阳性。3.术后2周,两组即可观察到上皮及浅基质层有新生的神经纤维；术后1个月,A组浅基质层已可见到少量新生的神经纤维相互连成网状；术后3个月,两组新生神经纤维数量明显增多,均可见到网络结构以及较多侧枝形成；术后6个月,A组新生神经纤维数量明显多于B组,且结构更为完善,两组均可见到部分神经断端没有再生,两组神经纤维数量远远少于正常对照眼。A组各时间点新生神经纤维数量明显高于B组,两组差异均有统计学意义(t=13.57, t=15.71, t=38.22,t=34.11,P<0.05)。结论：1.RHC-Ⅲ/PMPDSAH IPN水凝胶有良好的透明度和折光指数,但力学性能稍差,有待进一步加强。2.RHC-Ⅲ/PMPDSAH IPN水凝胶与兔角膜的生物相容性较好,安全性较高,但因其力学强度稍差,还不能完全替代同种异体角膜。3.NGF可以有效促进兔角膜板层移植术后的角膜创伤修复。4.本实验将NGF加入到角膜移植材料中,形成一种活性复合组织工程角膜,方法可行有效,国内尚未见到类似报道,有一定的创新性。5.角膜神经氯化金染色在缺少共聚焦显微镜的情况下,不失为一种良好的观察角膜神经的组织学检查方法。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-12
缩略语/符号说明  12-13
前言  13-16
  研究现状、成果  13-14
  研究目的、方法  14-16
一、重组人Ⅲ型胶原基组织工程角膜植入兔眼生物相容性的实验研究  16-34
  1.1 对象和方法  16-19
    1.1.1 对象  16-17
    1.1.2 方法  17-19
  1.2 结果  19-27
    1.2.1 材料性能  19-20
    1.2.2 临床观察  20-25
    1.2.3 组织学观察  25-27
  1.3 讨论  27-32
    1.3.1 实验动物的选择  27-28
    1.3.2 RHC-Ⅲ/PMPDSAH IPN的生物特性  28-30
    1.3.3 NGF对角膜创伤修复的作用及其机制  30-32
  1.4 小结  32-34
二、神经生长因子对兔角膜板层移植术后神经再生的作用  34-42
  2.1 对象和方法  34-36
    2.1.1 对象  34
    2.1.2 方法  34-36
  2.2 结果  36-39
    2.2.1 材料性能  36
    2.2.2 兔角膜板层移植术后神经氯化金染色  36-39
  2.3 讨论  39-40
    2.3.1 观察方法和时间的选择  39
    2.3.2 角膜神经受损的影响和再生  39
    2.3.3 NGF对角膜神经修复的作用  39-40
  2.4 小结  40-42
结论  42-43
参考文献  43-49
发表论文和参加科研情况说明  49-50
综述  50-57
  综述参考文献  53-57
致谢  57

兔眼移植重组人Ⅲ型胶原基组织工程角膜的实验研究

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