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辛辛那提弧菌、哈维氏弧菌和鳗弧菌活的非可培养状态的研究

作　者: 钟琳红
导　师: 陈吉祥
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 辛辛那提弧菌鳗弧菌哈维氏弧菌活的非可培养状态复苏毒力特征生理特性基因表达
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 55次
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内容摘要

活的非可培养状态（viable but nonculturable state,VBNC）是细菌处于不良环境下的一种特殊存活形式。处于非可培养状态的细菌用常规方法培养不能生长繁殖,但仍具有代谢活性,这种状态的细菌在适当的条件下能恢复为可培养状态。本文对辛辛那提弧菌（Vibrio cincinnatiensis）、鳗弧菌（V.anguillarum）、哈维氏弧菌（V.harveyi）等致病性弧菌活的非可培养状态的生理生化特征、基因表达及致病性特征进行了研究。辛辛那提弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌分别接种在自然海水或人工海水中,用吖啶橙染色荧光显微镜直接计数法（AODC）,活菌直接计数法（DVC）,涂布平板法（PC）检测几种病原菌在不同时间段的存活情况。结果发现在低温寡营养条件下进行培养时,辛辛那提弧菌在50d左右进入活的非可培养状态,鳗弧菌在不同诱导介质中具有较强的生存能力,在陈海水和人工海水中保存时间18个月后,其可培养数仍为10³-10⁴CFU/ml,而在MMS或0.5%-MMS饥饿培养基中保存,初期可培养细菌数下降较快,后逐渐变慢,并有上升趋势,在252d时可培养细菌数达到10⁴CFU/ml。总菌数与初期相比,没有太大的变化,活菌数比总菌数低两到三个数量级,且稳定在这一低水平。用荧光显微镜、透射电镜对辛辛那提弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌的正常状态、VBNC状态细胞进行研究表明,正常状态细胞形态呈弧状或杆状,VBNC状态下细胞结构发生了明显的变化,其细胞成球状,细胞的周质空间明显变大,个别细胞膜突起,成空泡状,复苏后的细胞与正常状态的细胞形态和大小相似,细胞结构完整;经诱导14个月后的鳗弧菌菌体细胞形成球状,且有明显扩大的周质间隙。用不同方法对VBNC状态下辛辛那提弧菌进行复苏,发现经添加营养物质后升温培养,可以使非可培养的辛辛那提弧菌复苏为可培养状态。将辛辛那提弧菌正常状态细胞、VBNC状态细胞和复苏状态细胞注射斑马鱼,结果发现注射正常状态细胞的斑马鱼出现死亡,其LD₅₀为3.87×10⁵CFU/L,注射VBNC细胞的斑马鱼始终保持存活状态,注射复苏状态的细胞的斑马鱼出现死亡,其LD₅₀为2.77×10⁵CFU/L,死亡的斑马鱼都呈现出了相似的症状,表明VBNC状态的辛辛那提弧菌可能保持致病潜能,当复苏为可培养状态时,恢复了致病性。对进入VBNC状态后复苏的哈维氏弧菌生理特征进行了研究,结果发现复苏的哈维氏弧菌恢复正常形态,对紫外辐射,热激的抵抗能力,对高渗透压的抵抗力减弱,而对冷激的抵抗力增强。RT—PCR检测表明复苏的细胞Ser和rpoS基因都有表达,而在VBNC状态时没有检测到这些基因的表达。表明哈维氏弧菌复苏后对不良环境的抵抗力没有明显改变,复苏细胞恢复了部分毒力相关基因的表达,可能是其保持致病性的重要原因之一。利用基因芯片表达技术对不同状态下哈维氏弧菌进行了基因表达分析。结果发现哈维氏弧菌在VBNC状态时,有893个基因的表达发生变化,其中上调基因有430个,下调基因263个;复苏细胞有976个基因表达发生变化,其中上调基因有197个,下调基因779个。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
0 前言  11-21
1 辛辛那提弧菌"活的非可培养状态"的形成及特征  21-33
  1.1 材料与方法  21-24
    1.1.1 实验菌株  21-22
    1.1.2 实验水体  22
    1.1.3 细菌的培养  22
    1.1.4 细菌总数检测和细胞形态观察  22-23
    1.1.5 VBNC状态辛辛那提弧菌VIB287细胞的复苏  23
    1.1.6 不同状态下辛辛那提弧菌VIB287的扫描电镜观察  23
    1.1.7 不同状态下辛辛那提弧菌VIB287的透射电镜观察  23-24
    1.1.8 VBNC状态及复苏状态的辛辛那提弧菌细胞的毒力测定  24
  1.2 结果  24-29
    1.2.1 辛辛那提弧菌在低温寡营养条件下的存活曲线  24-25
    1.2.2 VBNC状态的辛辛那提弧菌形态变化  25-27
    1.2.3 VBNC状态的辛辛那提弧菌的复苏  27-28
    1.2.4 不同状态的辛辛那提弧菌的毒力测定  28-29
  1.3 讨论  29-33
2 非可培养状态哈维氏弧菌复苏后生理特征及毒力相关基因表达  33-44
  2.1 材料与方法  33-36
    2.1.1 实验菌株  33-34
    2.1.2 哈维氏弧菌VBNC状态的诱导及复苏  34
    2.1.3 哈维氏弧菌的透射电镜观察  34
    2.1.4 复苏的哈维氏弧菌对环境应激的敏感性  34-35
    2.1.5 RT-PCR检测哈维氏弧菌毒力基因表达  35-36
  2.2 结果  36-41
    2.2.1 复苏的哈维氏弧菌的透射电镜观察  36-37
    2.2.2 复苏的哈维氏弧菌对环境应激的抵抗力  37-38
    2.2.3 复苏的哈维氏弧菌毒力基因表达  38-41
  2.3 讨论  41-44
3 鳗弧菌活的非可培养状态的初步研究  44-54
  3.1 材料与方法  44-47
    3.1.1 实验菌株  44-45
    3.1.2 实验水体  45
    3.1.3 细菌培养  45
    3.1.4 细菌数和细菌形态的检测  45
    3.1.5 不同状态下鳗弧菌CW1的透射电镜观察  45
    3.1.6 鳗弧菌长时期处于低温(4℃)寡营养状态下几种基因的表达  45-47
  3.2 结果  47-52
    3.2.1 鳗弧菌CW1在不同介质中低温饥饿状态下的存活曲线  47-49
    3.2.2 荧光显微镜下鳗弧菌的形态特征  49-50
    3.2.3 透射电镜下鳗弧菌的形态特征  50
    3.2.4 RT-PCR检测鳗弧菌的相关基因  50-52
  3.3 讨论  52-54
4 结论  54-55
参考文献  55-64
致谢  64-65
个人简历  65
发表的学术论文  65

辛辛那提弧菌、哈维氏弧菌和鳗弧菌活的非可培养状态的研究

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