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斑马鱼胚胎发育技术诊断百草枯的生物毒性研究

作　者: 刘菲
导　师: 康维钧；石红梅
学　校: 河北医科大学
专　业: 卫生毒理学
关键词: 百草枯 DNA 荧光光谱斑马鱼胚胎发育高效液相色谱法流动注射化学发光
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

近年来,除草剂大量应用于农业及环境绿化,与人类接触广泛,其对人类健康的影响逐渐受到重视。百草枯为目前应用较为广泛的一类除草剂。随着其日益推广使用,百草枯中毒事件呈逐年上升趋势,中毒的病死率较高,治疗也异常的困难。鉴于农田施用的大部分除草剂最终都进入自然水体,这无疑也会对水生环境造成影响。而且目前百草枯所应用的提取及检测方法,样品处理较费时费力,不宜推广使用。因此,研究百草枯的生物毒性,建立简便、灵敏、经济实用的检测方法即显得尤为重要。本文建立了离子对高效液相色谱法和流动注射化学发光法测定植物中的百草枯,并通过研究百草枯与DNA的相互作用、百草枯对斑马鱼胚胎发育的生态毒性诊断研究,来评价百草枯对生物体健康的影响。目的:1建立植物中百草枯简便﹑灵敏的高效液相色谱分析方法,考察冰箱中及自然环境两种条件下菠菜中百草枯的代谢情况。2建立测定百草枯的流动注射化学发光新方法。3研究百草枯与DNA之间的相互作用模式。4观察百草枯对斑马鱼胚胎发育各阶段毒理学终点的影响,初步探讨百草枯对水生生物的毒性。方法:1样品中加入甲醇/pH4-5的盐酸水溶液(1:1),浸泡过夜后经超声提取,再用C18固相柱萃取百草枯,离子对反相液相色谱法对植物中的百草枯进行分析,流动相为0.18mol/L磷酸缓冲液含18mmol己烷磺酸钠:乙腈=9:1,用二乙胺调节pH=2,检测波长为256nm。在菠菜中添加百草枯后分别放置于冰箱和自然环境中,添加浓度分别为10.0μg/ml和100.0μg/ml,于24h、48h、72h观察百草枯的代谢情况。2在碱性条件下,Ag(III)可以氧化鲁米诺产生稳定的化学发光信号,百草枯能增强鲁米诺-Ag(III)体系的化学发光作用,且发光强度与百草枯的浓度在一定范围内呈良好的线性关系。取10.0g样品于250ml烧杯中,用100ml蒸馏水洗涤并浸泡1h后在超声波清洗器中处理15min,取洗涤液进样测定。3采用紫外分光光度法、荧光分光光度法观察了不同浓度百草枯对NR-ctDNA体系的紫外光谱、荧光光谱的影响,同时研究了离子强度对百草枯-DNA混合体系的影响,实验结果用Stern-Volmer方程进行数据处理。4用不同浓度的百草枯对受精后0小时的斑马鱼胚胎进行染毒,观察染毒后4、8、12、16、24、36、48、72小时不同的毒理学终点,并用LD50统计软件计算各个终点的EC50值。结果:1建立了植物中百草枯简便﹑灵敏的高效液相色谱分析方法,该方法的最低检出限为10ng/ml(s/n=3),标准曲线回归方程为:Y=1.21×104X+8.46×102,其相关系数r=0.9997,加标回收率为82.6%,相对标准偏差为3.58%。冰箱中的百草枯48h的代谢率为46.5%,自然环境下百草枯48h的代谢率为81.0%。2流动注射化学发光法测定百草枯的最低检出限为3.4×10-6mol/L。线性范围为1.0×10-5-1.0×10-3mol/L,回归方程为△I=2.95×107C + 3.76×102 ,相关系数r=0.997。对2.0×10-4mol/L的百草枯连续进行平行测定11次,相对标准偏差为1.0%,加标回收率在85.4%-109.2%之间。3 pH=7.3的Tris-HCL缓冲溶液中,百草枯在260nm处有紫外吸收峰,且百草枯对NR-ctDNA体系的紫外光谱和荧光光谱均能产生有规律的影响。4从发育4h开始,百草枯对斑马鱼胚胎发育有明显的效应,在显微镜下可以观察到卵凝结、无心跳、无血液循环、心包水肿等异常表现,百草枯对斑马鱼胚胎发育最重要的影响是72h孵化,其EC50=387.6mmol/L,而孵化后的各种畸形与阴性对照组相比未见明显差别。结论:1离子对高效液相色谱法测定植物中的百草枯方法简便,结果满意,百草枯在自然环境中的代谢速度高于放置在冰箱中的代谢速度。2化学发光法测定蔬菜中百草枯的残留量,方法简便快捷、准确可靠。3通过综合紫外光谱,荧光光谱及氯化钠对百草枯-DNA体系荧光强度的影响几个部分的实验,表明百草枯与DNA之间存在静电和嵌插两种作用。4利用斑马鱼受精卵为生物材料进行胚胎发育试验,在观察到的毒理学终点中,72h孵化最为敏感,4h卵凝结次之,这两个指标均为Ⅰ类致死性指标,百草枯对斑马鱼胚胎发育的影响集中表现为致死效应。

全文目录

中文摘要  5-9
英文摘要  9-13
研究论文斑马鱼胚胎发育技术诊断百草枯的生物毒性研究  13-52
  第一部分离子对高效液相色谱法测定植物中的百草枯  13-21
    前言  13
    材料与方法  13-15
    结果  15-17
    附图  17-18
    附表  18-19
    讨论  19
    小结  19-20
    参考文献  20-21
  第二部分流动注射－化学发光法测定百草枯  21-30
    前言  21
    材料与方法  21-23
    结果  23-25
    附图  25-27
    附表  27
    讨论  27-28
    小结  28-29
    参考文献  29-30
  第三部分荧光探针法研究百草枯与DNA 的相互作用  30-40
    前言  30
    材料与方法  30-32
    结果  32-34
    附图  34-37
    讨论  37
    小结  37-38
    参考文献  38-40
  第四部分百草枯对斑马鱼胚胎发育的生态毒性诊断研究  40-52
    前言  40-41
    材料与方法  41-42
    结果  42-44
    附图  44-48
    附表  48-49
    讨论  49-50
    小结  50
    参考文献  50-52
综述百草枯中毒研究  52-64
  参考文献  60-64
致谢  64-65
个人简历  65

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