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定量检测人超敏C-反应蛋白双抗体夹心ELISA方法的建立及初步临床应用

作　者: 沈丹丹
导　师: 何国平
学　校: 江苏大学
专　业: 内科学
关键词: 定量检测超敏C-反应蛋白 ELISA双抗体夹心法
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 93次
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内容摘要

背景:C-反应蛋白(CRP)是一种高度保守的血浆蛋白,在脊椎动物和多种非脊椎动物中存在同系物,参与全身炎症反应。机体处于炎症状态时,其血浆CRP浓度升高,因此CRP作为炎症标记物被广泛应用于临床。CRP是一种模式识别分子,通常与死亡细胞或病原体表面的特殊分子构型结合。在组织损伤或感染后数小时内,其合成迅速增加,提示CRP参与机体的宿主防御和固有免疫反应。最近,血浆CRP水平的轻微升高和未来心血管事件的相关性被广泛证实。因此,建立高灵敏度的CRP测定方法是一项重要的实用性研究领域,引起研究工作者和临床医生的兴趣和关注。目的:初步建立一种可用于检测人超敏C-反应蛋白(hs-CRP)的双抗体夹心ELISA方法,并初步探讨其临床应用价值。方法:1.采用Protein A亲和层析柱纯化本室制备的抗CRP单克隆抗体(mAb),并行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western-blot)对纯化抗体特性进行鉴定;利用简易过碘酸钠法对抗CRP mAb进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。2.采用dp-Aminophenyl phosphoryl Cholnie Gel亲和层析柱从肿瘤患者胸水中分离、纯化CRP,并通过SDS-PAGE与Western-blot检测其纯度与特异性。3.通过抗体配对实验确定最佳配对抗体,行方阵滴定法确定包被抗体和酶标抗体的最适工作浓度;以纯化的CRP抗原为标准品建立标准曲线;以重复性、灵敏性、回收性实验评价ELISA方法。4.对冠状动脉无狭窄者(冠脉正常组)68例、狭窄直径＜50%者(冠状动脉硬化症组)59例和狭窄直径≥50%者(冠心病组)67例采用双抗体夹心ELISA方法测定血浆hs-CRP水平。5.统计学方法:采用SPSS16.0软件包进行统计分析。Hs-CRP数据呈非正态分布,以中位数(M)和四分位数间距(QR)表示。非正态分布资料多组间比较用Kruskal-Wallis检验,两两比较用Mann-Whitney检验。结果:1.采用protein A亲和层析柱从小鼠腹水中纯化出55KD、25KD各一条带,SDS-PAGE检测纯度超过95%的蛋白,行western-blot检测未见杂带。并行HRP酶标,酶标抗体行western-blot检测未见杂带。2.采用dp-Aminophenyl phosphoryl Cholnie Gel亲和层析法从肿瘤患者胸水中成功纯化出大小为24KD蛋白,SDS-PAGE检测纯度超过95%,用抗CRP mAb进行western-blot检测未见杂带。3.最佳配对组合为抗CRP mAb 1C10和HRP标记抗CRP mAb 2C11,最适工作浓度分别为10ug/ml和1∶2000,该方法的批内、批间变异系数分别为3.1%～9.7%和3.6～13.6%,灵敏度达8.3ng/ml,回收率为90%～109%。4.用ELISA法测定的血浆hs-CRP水平:冠状动脉硬化症组明显高于冠脉正常组[(1.15±3.65mg/L)vs(0.74±1.75mg/L)](P＜0.05),冠心病组明显高于冠状动脉硬化症组[(3.29±8.93mg/L)vs(1.15±3.65mg/L)](P＜0.05)。结论:纯化、鉴定和标记了抗CRP mAb,纯化和鉴定了CRP抗原,初步建立了一种可用于临床检测CRP的双抗体夹心ELISA方法。

全文目录

摘要  6-9
ABSTRACT  9-13
第一章绪论  13-15
  1 国内外研究现状  13
  2 研究目的和意义  13
  3 主要研究内容  13-14
  4 论文特色和创新之处  14-15
第二章单克隆抗体的纯化、鉴定和标记  15-25
  材料和方法  16-21
  结果  21-22
  讨论  22-23
  小结  23-25
第三章 C-反应蛋白的纯化及鉴定  25-31
  材料和方法  25-27
  结果  27-30
  讨论  30
  小结  30-31
第四章定量检测hs-CRP双抗体夹心ELISA方法的初步建立和初步临床应用  31-39
  材料与方法  31-34
  结果  34-36
  讨论  36-37
  小结  37-39
参考文献  39-43
综述(一)  43-51
综述(二)  51-57
附录(一) 缩略语  57-59
附录(二) 在读期间研究成果  59-61
致谢  61

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