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目的:肠道梗阻、休克、严重多发性创伤以及腹主动脉瘤修补术和器官移植术等手术均有可能引起肠缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)损伤,进而引发全身感染,导致全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS )以及多脏器功能不全综合症( multiple organ dysfunction syndrome, MODS)。如何预防和减轻I/R损伤,一直是肠保护中的主要课题。本研究前期实验成功制备了大鼠肠I/R损伤模型及大鼠肠I/R损伤的缺血后处理(ischemia postconditioning, IPo )模型,观察到磷酸肌酸钠(creatine phosphate sodium CP)处理、缺血预处理( ischemia preconditioning, IP)联合IPo均能够通过提供能量,清除氧自由基,增强SOD活性,减轻脂质过氧化反应,抑制细胞凋亡而减轻大鼠肠I/R损伤。缺血再灌注损伤是由许多因素造成的复杂的病理生理过程,缺血损伤能够导致严重的细胞损伤,而损伤进一步被再灌注时各种细胞内来源的活性氧加重;此外,炎性介质前体的形成,巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞的聚集和活化也会进一步加重损伤;微循环的阻塞可导致无灌流区域的形成引起缺血损伤。针对单一介质或机制的保护措施达到理想的保护效果是很困难的。本研究目的是探讨磷酸肌酸钠、缺血预处理、缺血后处理联合对大鼠肠I/R损伤的影响及其机制,为临床保护肠缺血再灌注损伤寻求一种新的、更合理的方式,为减轻肠损伤,保护肠功能提供理论依据。方法: 40只Wistar雄性大鼠,体重250-300g,随机分为5组,每组8只,①假手术组(S组),②缺血再灌注组(I/R组),③磷酸肌酸钠处理组(C组),④缺血预处理联合后处理组(IP+IPo组),⑤磷酸肌酸钠、缺血预处理联合后处理组(C+IP+IPo组)。10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉,一侧颈内静脉穿刺,0.9%生理盐水1ml/kg·h持续泵入。采用夹闭肠系膜上动脉(superior mesenteric artery ,SMA)60min,再灌注120min制备肠缺血再灌注损伤模型。用无创动脉夹夹闭SMA,肠颜色由鲜红变为暗红色即可确认肠血流被阻断,造成肠缺血60min后,松开动脉夹,肠由暗红色恢复鲜红色即可确认血流恢复。①假手术组(S组):仅行开腹,游离并暴露SMA,不行肠I/R及磷酸肌酸钠注射,切口用生理盐水纱布覆盖,暴露180min;②缺血再灌注组(I/R):暴露腹腔后夹闭SMA60min,开放再灌注120min;③磷酸肌酸钠处理组(C组):在肠缺血前5min静脉缓慢给予磷酸肌酸钠1g/kg,再灌注前5min再次静脉缓慢给予磷酸肌酸钠1g/kg;④缺血预处理联合后处理组(IP+IPo组):在缺血前先给予夹闭SMA5min,再灌注5min,反复3次,夹闭SMA60min后再灌注30s,缺血30s,反复3次,再恢复血液灌注120min;⑤磷酸肌酸钠、缺血预处理联合后处理组(C+IP+IPo组):缺血前5min给予磷酸肌酸钠1g/kg,再灌注前5min给予磷酸肌酸钠1g/kg,其余操作同IP+IPo组。所有动物于再灌注120min时处死。比色法测定血清丙二醛(MDA)含量、超氧化物岐化酶(SOD)活性和肠组织MDA含量、SOD活性;考马斯亮兰法测定肠组织蛋白含量;采用免疫组化(SP)法观察肠组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、和Caspase-3的表达,计算蛋白阳性染色指数(positive index,PI);肠组织含水率测定;苏木素-伊红(He)染色观察肠组织病理学变化。结果:1血清和肠组织的SOD活性和MDA含量的变化与S组相比,I/R组、C组、IP+IPo组肠组织SOD活性降低,MDA含量升高,差异有统计学意义(P﹤0.05);I/R组、C组、IP+IPo组及C+IP+IPo组血清SOD活性降低,MDA含量增加,差异有统计学意义(P﹤0.05)。与I/R组比较,C组、IP+IPo组、P+IP+IPo组血清和肠组织中的SOD活性均升高,MDA含量均减少,差异有统计学意义(P﹤0.05)。与P+IP+IPo组比较,C组、IP+IPo组血清SOD活性降低,差异有统计学意义(P﹤0.05);IP+IPo组肠组织SOD活性降低,差异有统计学意义(P﹤0.05)。其余各组之间比较差别不大,无统计学意义(P﹥0.05)。2采用免疫组化(SP)法观察肠组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、和Caspase-3的表达与S组比较,I/R组、C组、IP+IPo组及C+IP+IPo组Bcl-2蛋白PI降低,差异有统计学意义(P﹤0.05),Bax蛋白PI升高,差异有统计学意义(P﹤0.05),Caspase-3蛋白PI升高,差异有统计学意义(P﹤0.05)。与I/R组比较,C组、IP+IPo组及P+IP+IPo组Bcl-2蛋白PI升高,差异有统计学意义(P﹤0.05),Bax蛋白PI降低,差异有统计学意义(P﹤0.05),Caspase-3蛋白PI降低,差异有统计学意义(P﹤0.05)。与P+IP+IPo组比较,IP+IPo组Bax蛋白PI升高,差异有统计学意义(P﹤0.05), C组Caspase-3蛋白PI升高,差异有统计学意义(P﹤0.05)。其余各组之间比较差别不大,无统计学意义(P﹥0.05)3肠含水率的变化与S组比较,I/R组、C组、IP+IPo组及C+IP+IPo组肠组织含水率升高,差异有统计学意义(P﹤0.05)。与I/R组比较,C组、IP+IPo组及P+IP+IPo组组织含水率降低,差异有统计学意义(P﹤0.05)。其余各组之间比较差别不大,无统计学意义(P﹥0.05)。4光镜下观察肠组织的病理改变S组小肠粘膜结够正常;I/R组肠组织出现显著水肿,毛细血管淤血,红细胞多且连成片,白细胞明显增多;C组肠组织出现轻度水肿、淤血红细胞多连成片,白细胞少见;IP+IPo组及C+IP+IPo组肠组织改变轻微,水肿淤血轻,红细胞多但不连成片,白细胞少见。5考马斯亮蓝蛋白含量改变与S组比较,I/R组、C组、IP+IPo组及C+IP+IPo组蛋白含量明显增高,差异有统计学意义(P﹤0.05)。与I/R组相比C组、IP+IPo组及C+IP+IPo组蛋白含量明显降低,差异有统计学意义(P﹤0.05)。与P+IP+IPo组比较,C组、IP+IPo组蛋白含量明显增高,差异有统计学意义(P﹤0.05)。结论:1磷酸肌酸钠、缺血预处理联合后处理及磷酸肌酸钠、缺血预处理联合后处理均可减轻大鼠肠缺血再灌注损伤,改善肠功能。其主要机制可能与通过清除氧自由基,增强SOD活性,减轻脂质过氧化反应,增加Bcl-2蛋白的表达和降低Bax、Caspase-3蛋白的表达,从而使Bal-2/Bax比值升高而抑制细胞凋亡有关。2磷酸肌酸钠、缺血预处理联合后处理及磷酸肌酸钠、缺血预处理联合后处理具有相似的肠组织保护作用,磷酸肌酸钠、缺血预处理联合后处理的保护作用更好。
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