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赤拟谷盗细胞色素P450基因的克隆、序列分析及表达研究

作　者: 徐永强
导　师: 王进军
学　校: 西南大学
专　业: 农药学
关键词: 赤拟谷盗 P450 分子克隆实时荧光定量PCR
分类号: S379.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

细胞色素P450单加氧酶系(cytochrome P450 monooxygenases,P450s)为广泛分布于生物有机体内的重要酶系。细胞色素P450是P450s的末端氧化酶,在整个P450s中起着末端氧化酶(terminal oxidase)的作用,决定着P450s底物的广泛性和专一性。细胞色素P450参与许多重要的生命过程,对动物、植物、真菌和细菌等的研究表明许多不同催化反应都归功于细胞色素P450的作用。对于昆虫而言,细胞色素P450在昆虫的生命活动中起着十分重要的作用:如固醇类物质、保幼激素(JH)、昆虫信息素、脂肪酸及其相关化合物、防御物质和外源化合物的代谢等,甚至可以合成昆虫体内的长链烃类,具有重要的生物学和遗传学意义。目前已鉴定出200多个昆虫细胞色素P450基因全长或片段,分属于CYP4,CYP6,CYP9,CYP12,CYP15,CYP18,CYP28,CYP48,CYP305等基因家族。赤拟谷盗Tribolium castaneum(Herbst)是具有重要经济意义的世界性储粮害虫,在世界范围内分布广泛,我国绝大多数省(区)市均有分布,为害严重。此外,赤拟谷盗还是一种重要的模式昆虫,是第一个完成了基因组测序的鞘翅目昆虫。因此,从基因组水平对赤拟谷盗P450基因进行研究,不仅能为赤拟谷盗的防治提供理论依据,对于认识P450的生物学特性和遗传学特性也有重要意义。据此,本学位论文在国家自然科学基金(30871631)的资助下,利用分子生物学和生物信息学方法对赤拟谷盗P450基因进行研究,获得的主要结果如下:1.P450基因的克隆及序列分析采用RT-PCR方法克隆获得了1个P450新基因CYP6BK17的全长序列。CYP6BK17全长1816bp,GenBank登录号为EU266589,包括由34个核苷酸组成的5’UTR(5’端非编码区)、由1515个核苷酸组成的ORF(开放阅读框)和由246个核苷酸组成的3’UTR(3’端非编码区)。ORF编码515个氨基酸,预测蛋白含有血红素结合基序F××G×××C×G及所有细胞色素P450的特征基序,如位于螺旋K中参与稳定核心结构的E××R完全保守序列;N端含有由22个疏水氨基酸组成的跨膜锚定区域。另外,利用该方法还得到了另1个新基因(F06)的3’段序列,长614bp,GenBank登录号为EU924172,其编码区长度为414p,编码138个氨基酸残基,3’UTR含有198bp的核苷酸:推导的氨基酸序列中含三个P450超家族的特征性保守序列:ETLR区、PERF区以及血红素结合区域F××G×××C×G。根据赤拟谷盗基因组序列设计引物,克隆得到了CYP6BQ13基因的等位基因CYP6BQ13v2,两者相似性为98%,其ORF长度为1554bp,GenBank登录号为FJ209361。ORF编码518个氨基酸,其中N端含有由17个疏水氨基酸组成的跨膜锚定区域;推定的氨基酸序列包含所有昆虫P450基因的5个特征序列,如血红素结合基序F××G×××C×G、ETLR区等。2.生物信息学分析CYP6BK17基因编码的蛋白质预测分子量为58.77kDa,理论等电点为9.26:在该数据库SWISS-MODEL中搜索发现与其同源性最高的是人类肝脏的CYP3A4(32%),以CYP3A4蛋白质晶体结构为模板进行同源模建,得到了CYP6BK17的三维结构模型,找到了赤拟谷盗的酶解活性中心半胱氨酸Cys442。CYP6BQ13v2基因推定的氨基酸序列预测分子量为59.92KDa,理论等电点为7.60;用Sim4程序对CYP6BQ13v2基因的外显子/内含子结构进行分析发现该基因含有3个外显子,2个内含子,外显子/内含子边界符合GT-AG规则;通过基因组数据进行本地BLAST发现CYP6BQ1l3v2基因的cDNA序列只与一个contig(CtgAAJJ01000808,第2染色体)具有较高的相似性,表明该基因为单克隆基因。3.系统发育分析从GeneBank数据库中收集来自10个物种的19条细胞色素P450基因序列,其中有5条来自哺乳动物,其余均来自昆虫。利用MEGA3.0构建CYP6BK17的分子进化树。系统进化树分析表明CYP6BK17与来源于赤拟谷盗的CYP6BK10和CYP6BK1的同缘关系最近,其次是来源于家蝇(Musca domestica)的CYP6A1和CYP6C1,以及来源于尖音库蚊(Culex pipienspipiens)的CYP6E1。从GeneBank数据库中收集来自12个物种的22条细胞色素P450基因序列,利用MEGA3.0构建CYP6BQ13v2的分子进化树。系统发育分析表明,CYP6BQ13v2与代谢蜕皮激素、来源于家蚕(Bombyx mori)的CYP302A1和来源于果蝇(Drosophila melanogaster)的CYP307A1的同缘关系较近。4.基因表达研究将CYP6BK17克隆到表达载体pDest-17的多克隆位点区,然后将重组表达载体转化到BL21(DE3)菌中,成功建立了CYP6BK17基因的原核表达系统。Real-time PCR结果表明CYP6BQ13v2在被检测的赤拟谷盗的各个发育历期均有表达,其中在蛹期的表达水平最低,1龄幼虫期的表达水平最高,是蛹的14.9倍,成虫的3.86倍;总体上随着虫龄的增加呈递减趋势,具体为:1龄幼虫＞4龄幼虫＞7龄幼虫＞虫＞蛹。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
第一章文献综述  12-26
  1 赤拟谷盗  12-14
    1.1 赤拟谷盗的发生与危害  12-13
    1.2 赤拟谷盗作为模式生物研究进展  13-14
  2 细胞色素P450酶系与细胞色素P450氧化酶  14-19
    2.1 细胞色素P450酶系  14-15
    2.2 细胞色素P450氧化酶  15-19
  3 P450基因克隆策略  19-21
    3.1 分离纯化P450蛋白  19
    3.2 用已知的昆虫P450基因为探针筛选  19-20
    3.3 设计简并引物进行PCR和RT-PCR策略  20
    3.4 RT-PCR克隆差示筛选(Differential screening)  20
    3.5 利用全基因组序列预测P450基因并设计引物克隆全长基因  20-21
  4 系统进化分析和同源模建  21
  5 昆虫细胞色素P450的表达  21-26
    5.1 昆虫细胞色素P450基因的异源表达  21-24
    5.2 实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)技术  24-26
前言  26-28
第二章赤拟谷盗CYP6BK17基因CDNA的克隆及序列分析  28-48
  1 试验材料与方法  28-39
    1.1 供试昆虫及饲养条件  28-29
    1.2 主要试剂和仪器  29-31
    1.3 总RNA提取和cDNA第一链的合成  31-32
    1.4 P450基因片断的扩增、克隆、测序  32-35
    1.5 采用RACE技术克隆细胞色素P450基因全长  35-38
    1.6 CYP6BK17 cDNA全长的验证  38-39
    1.7 序列分析  39
  2 结果与分析  39-44
    2.1 赤拟谷盗总RNA的提取  39-40
    2.2 CYP6BK17片段的扩增  40-41
    2.3 通过RACE技术获得P450基因的序列全长  41
    2.4 CYP6BK17 cDNA全长的验证  41
    2.5 赤拟谷盗CYP6BK17基因全序列分析  41-43
    2.6 P450基因CYP6BK17与其他P450基因的一致性分析  43-44
  3 讨论  44-48
第三章 CYP6BK17的系统发育分析及原核表达  48-54
  1 材料和方法  48-49
    1.1 CYP6BK17的同源模建  48
    1.2 P450基因CYP6BK17分子进化树的构建  48
    1.3 P450基因CYP6BK17的原核表达  48-49
  2 结果与分析  49-52
    2.1 CYP6BK17蛋白的同源结构模建  49
    2.2 CYP6BK17分子进化树的构建及系统发育分析  49-51
    2.3 CYP6BK17的原核表达  51-52
  3 讨论  52-54
第四章 CYP6BQ13V2的克隆及序列分析  54-62
  1 材料与方法  54-56
    1.1 实验材料、主要试剂及仪器  54
    1.2 引物设计与合成  54-55
    1.3 PCR扩增  55
    1.4 序列分析  55
    1.5 基因结构分析  55-56
    1.6 P450基因CYP6BQ13v2分子进化树的构建  56
  2.结果与分析  56-59
    2.1 DNA扩增结果  56
    2.2 基因序列分析  56-58
    2.3 CYP6BQ13v2基因结构分析  58
    2.4 CYP6BQ13v2分子进化树的构建及系统发育分析  58-59
  3 讨论  59-62
第五章 CYP6BQ13V2基因在不同发育历期中的表达  62-66
  1 材料和方法  62-63
    1.1 总RNA提取和cDNA第一链的合成  62
    1.2 定量引物的制备  62
    1.3 PCR产物熔解曲线及荧光定量PCR扩增效率一致性的验证  62-63
    1.4 实时荧光定量PCR扩增  63
  2 结果与分析  63-65
    2.1 PCR产物熔解曲线及荧光定量PCR扩增效率一致性的验证  63-64
    2.2 CYP6BQ13v2基因在各发育历期中相对表达量的比较  64-65
  3 讨论  65-66
第六章结论与展望  66-68
  1 主要结论  66
    1.1 P450基因的克隆  66
    1.2 生物信息学分析  66
    1.3 表达研究  66
  2 展望  66-68
参考文献  68-80
缩略词  80-82
在学期间发表的论文  82-84
致谢  84

赤拟谷盗细胞色素P450基因的克隆、序列分析及表达研究

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