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非小细胞肺癌microRNA-21检测技术的研究
作 者: 李艳昭
导 师: 汤建新;胡舜钦
学 校: 湖南工业大学
专 业: 生物医学工程
关键词: 肺癌 microRNA 实时荧光定量PCR 电化学阻抗 微电极
分类号: R734.2
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
如今临床应用的肿瘤标记物一方面促进了肿瘤诊断技术的发展,另一方面又由于具有较大的创伤性和不稳定性,其临床应用受到限制。越来越多的报道提出microRNA生物标记物在癌症治疗方面有着十分重要的潜在价值。其中血液microRNA作为肿瘤诊断和预后分子标记物,具有创伤小、稳定、便捷的优势。然而传统的microRNA检测技术大都需要较多的步骤,由此带来的操作误差会影响检测的结果,需要发展新的检测技术以简化操作过程,避免操作误差,提高检测准确度。电化学交流阻抗技术具有检测特异性好、灵敏度高、操作简便等特点,可以与其它检测技术相结合,提高microRNA检测的水平。本论文主要开展了如下几个方面的工作:(1)采用实时荧光定量PCR技术检测肺癌患者与正常人群血液中miR-21的浓度水平,并比较二者的表达差异,根据临床病理特征对miR-21的表达量进行统计分析,评估miR-21对肺癌的诊断价值。(2)基于电化学刻蚀技术制备了传感器用微电极,并优化了微电极制备过程中的反应条件。用扫描电镜及循环伏安法对制备的微电极进行表征,分析了微电极的稳定性和可逆性。(3)首先利用巯基自组装技术构建阻抗型电化学生物传感器。通过Au-S的强静电吸附作用,将巯基标记的核酸探针自组装到镀金的微电极表面,形成RISC-miRNA复合物识别层,并用十二硫醇对传感器表面非探针空位点进行封闭处理,抑制非特异性吸附。其次,利用该传感器检测肺癌患者血液中RISC-miR-21复合物,测量探针与复合物结合前后传感器表面电子传递电阻Ret的增量,从而对microRNA复合物实现定量检测。最后,对生物传感器的检测条件进行了优化,使检测效果达到最佳。主要得到以下结论:(1)通过实时荧光定量PCR检测肺癌患者与正常人群血液中miR-21的表达水平,得到肺癌患者血液中的miR-21含量明显高于正常人群(P<0.01)。20例肺癌患者的样本中,85 %(17/20)的样本中miR-21的表达是上调的。统计结果表明miR-21的异常表达与样本的各项临床特征无关(P>0.05)。受试者工作特征曲线(ROC)分析结果显示曲线下的面积大小(AUC)约为0.912±0.045,表现为78.80 %的敏感性和100 %的特异性,说明miR-21作为潜在分子标记有较好的实验诊断效能。血液miR-21可能成为预测肺癌的生物标记物之一。(2)应用电化学刻蚀法成功制备了合金微电极,用扫描电镜(SEM)表征微电极的表面形貌并估计了有效半径;用电化学工作站对微电极进行循环伏安分析。表征结果表明:0.1 mol/L的KCl溶液,5 V电压条件下所制备的微电极的性能最佳,有效半径在5μm以下;循环伏安响应曲线表明所制备的电极的导电性能良好;微电极具有很好的可逆性和稳定性。(3)利用巯基自组装技术成功构建了电化学阻抗生物传感器。利用该传感器检测RISC-miR-21复合物,交流阻抗测试结果显示巯基探针可以很好的自组装到电极表面,使[Fe(CN)6]3-/4-平衡电对向电极表面的扩散存在阻碍。电极表面用十二硫醇进行封闭处理后,电子传递电阻Ret会增加。探针与RISC-miR-21复合物的结合又进一步阻碍了[Fe(CN)6] 3-/4-平衡电对的活动,电子传递电阻Ret继续增加。通过对电化学阻抗生物传感器检测条件的优化,得知探针与RISC-miR-21复合物在36℃培育30 min后再进行检测效果最佳。
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全文目录
摘要 4-6 ABSTRACT 6-11 第一章 绪论 11-29 1.1 MicroRNA 11-16 1.1.1 MicroRNA 的发现 11-12 1.1.2 MicroRNA 的命名及在基因组中的位置 12 1.1.3 MicroRNA 的加工与成熟 12-13 1.1.4 MicroRNA 的作用机制 13-14 1.1.5 MicroRNA 与肿瘤 14-16 1.2 MicroRNA 检测技术 16-19 1.2.1 Northern blotting 16-17 1.2.2 RT-PCR 技术 17-18 1.2.3 基因芯片 18 1.2.4 其它检测方法 18-19 1.3 电化学交流阻抗技术 19-24 1.3.1 基本原理 20 1.3.2 主要特点 20-21 1.3.3 等效电路 21 1.3.4 表示方法 21-23 1.3.5 应用前景 23-24 1.4 研究背景、内容及意义 24-29 1.4.1 研究背景 24-27 1.4.2 研究内容 27-28 1.4.3 研究意义 28-29 第二章 实时荧光定量PCR检测microRNA研究 29-38 2.1 MicroRNA 的提取 29-32 2.1.1 血液标本 29-30 2.1.2 主要仪器 30 2.1.3 主要试剂 30 2.1.4 操作步骤 30-32 2.2 MicroRNA-21 的逆转录 32-33 2.3 实时荧光定量PCR 检测microRNA-21 33-36 2.3.1 实验原理 33 2.3.2 实验步骤 33-34 2.3.3 实验结果 34-36 2.4 本章小结 36-38 第三章 微电极制备与性能研究 38-47 3.1 实验材料与设备 38-39 3.2 微电极的制备 39-42 3.2.1 电极制备原理 39-40 3.2.2 电极制备条件的选择 40-42 3.3 微电极的预处理与表征 42-43 3.3.1 表面光滑处理 42 3.3.2 微电极的绝缘 42 3.3.3 去除尖端绝缘层 42 3.3.4 微电极有效半径计算 42-43 3.4 微电极的性能研究 43-46 3.4.1 微电极可逆性研究 45-46 3.4.2 微电极稳定性研究 46 3.5 本章小结 46-47 第四章 电化学阻抗生物传感器检测microRNA研究 47-54 4.1 电化学阻抗生物传感器预处理 47-48 4.1.1 探针自组装 47-48 4.1.2 封闭处理 48 4.1.3 结合反应 48 4.2 电化学阻抗生物传感器检测RISC-miR-21 复合物 48-52 4.3 电化学阻抗生物传感器检测条件的优化 52-53 4.3.1 反应温度对传感器的影响 52-53 4.3.2 反应时间对传感器的影响 53 4.4 本章小结 53-54 第五章 总结与展望 54-56 5.1 总结 54 5.2 展望 54-56 参考文献 56-63 附录 63-64 致谢 64
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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
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