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己烯雌酚单克隆抗体制备与确证及其免疫亲和柱的试制

作　者: 伦丽丽
导　师: 董英
学　校: 江苏大学
专　业: 食品科学
关键词: 己烯雌酚完全抗原单克隆抗体免疫亲和层析
分类号: R155.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

已烯雌酚（Diethylstilbestrol,DES）作为一种人工合成的非甾醇类雌激素,在临床治疗、畜牧生产中有着广泛应用,但是DES的残留会对人体产生一系列的毒副作用。因此,许多国家和地区已明确禁止DES在食品动物中的使用。然而受经济利益的驱使,非法使用和滥用现象依然存在。为确保动物食品安全和我国畜牧水产品出口贸易的畅通,建立快速、灵敏的检测技术已成为当前迫切需要解决的一个重要问题。DES残留分析中,样品前处理是核心。免疫亲和层析技术与传统的样品前处理技术相比,操作简单、具有高选择性的净化和富集能力,是一种有着良好应用前景的样品前处理技术。本论文以免疫学为基础,制备并确证DES完全抗原和单克隆抗体,并对其免疫亲和层析柱的制备与使用技术进行初步研究,为建立以免疫亲和层析为核心的样品前处理技术奠定基础。主要研究内容和结果如下:1.琥珀酸酐法合成已烯雌酚半琥珀酸酯（DES-HS）,得率较高的反应条件为:DES、HS摩尔比为1:10;温度45℃;时间48 h。采用混合酸酐法和碳二亚胺法制备完全抗原,用紫外光谱法、SDS-PAGE、红外光谱法、高分辨率质谱法逐步确证和监测完全抗原的制备成功,并计算出载体蛋白BSA与DES-HS的偶联率为1:26。2.选择6～8周龄的Ballb/C雄性小鼠进行免疫,研究了免疫方式、免疫剂量、载体蛋白及免疫次数对免疫效价的影响。结果表明:背部皮下多点注射比腹腔注射免疫效价高;免疫剂量（100/50μg/只和200/100μg/只）对免疫效价无显著影响;KLH作载体的免疫效价高于BSA作载体;免疫四次即可获得较高的免疫效价。3.建立了DES间接非竞争ELISA法:100 ng DES/孔37℃包被2 h;5%的脱脂奶粉4℃封闭过夜;一抗37℃作用2 h;HRP-IgG 3000倍稀释,37℃反应2 h;显色液37℃作用15 min。4.利用PEG法进行细胞融合,采用有限稀释法进行三次亚克隆,筛选得到能稳定分泌抗DES的亚型为IgG3单抗的杂交瘤细胞株18G5。蛋白G亲和层析纯化腹水获得抗体蛋白。紫外光谱测定其浓度为1.015 mg/mL;SDS-PAGE显示其分子量约为150 KD;间接非竞争ELISA测定其效价为10000,最佳工作浓度为1000倍稀释;计算得其亲和常数为1.48×10⁹。间接竞争ELISA测得DES抑制标准曲线方程为y=-0.2145x+0.4713,R²=0.9965,线性区间为0.1～20 ng/mL,半抑制浓度IC₅₀为0.735 ng/mL;与结构类似物已烷雌酚、双烯雌酚的交叉反应率分别为0.37和0.98。5.以BrCN活化的Sepharose 4B为载体,以纯化的18G5的腹水型单克隆抗体作为配基,制备的免疫亲和层析柱对DES的回收率为62.2%。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第一章绪论  13-21
  1.1 己烯雌酚概述  13-15
    1.1.1 己烯雌酚的主要用途  13-14
    1.1.2 己烯雌酚的毒副作用  14-15
  1.2 己烯雌酚常用检测方法  15-17
    1.2.1 高效液相色谱  16
    1.2.2 气相色谱串联质谱  16
    1.2.3 液相色谱串联质谱  16
    1.2.4 免疫学检测  16-17
  1.3 畜产品中己烯雌酚残留检测的样品前处理技术  17-19
    1.3.1 传统溶剂萃取  17
    1.3.2 超声辅助萃取  17-18
    1.3.3 固相萃取  18
    1.3.4 免疫亲和层析  18-19
  1.4 立题依据与意义  19-20
  1.5 论文的主要研究内容  20-21
第二章完全抗原的的制备与确证  21-33
  2.1 引言  21
  2.2 试剂与仪器  21-22
    2.2.1 试剂  21-22
    2.2.2 主要仪器设备  22
  2.3 试验方法  22-26
    2.3.1 试剂的预处理  22-23
    2.3.2 DES-HS的制备及鉴定分析  23-25
    2.3.3 DES完全抗原的制备及鉴定分析  25-26
  2.4 结果与讨论  26-32
    2.4.1 DES-HS合成条件的优化结果  26-28
    2.4.2 DES-HS的红外光谱分析  28-29
    2.4.3 DES-HS-BSA的紫外光谱分析  29
    2.4.4 DES-HS-BSA的红外光谱分析  29-30
    2.4.5 DES-HS-BSA的SDS-PAGE  30
    2.4.6 DES-HS-BSA的高分辨率质谱检测  30-32
  2.5 本章小结  32-33
第三章动物免疫及DES间接非竞争ELISA法的建立  33-49
  3.1 引言  33
  3.2 试剂与仪器  33-34
    3.2.1 主要试剂  33-34
    3.2.2 主要仪器设备  34
  3.3 试验动物  34
  3.4 试验方法  34-40
    3.4.1 完全抗原溶液的配制  34
    3.4.2 DES-HS-BSA免疫小鼠  34-35
    3.4.3 DES-HS-KLH免疫小鼠  35-36
    3.4.4 间接非竞争ELISA检测方法的建立  36-40
    3.4.5 抗血清的效价测定  40
  3.5 结果与分析  40-48
    3.5.1 间接非竞争ELISA检测方法的建立  40-46
    3.5.2 免疫方法和免疫剂量对免疫效价的影响  46
    3.5.3 不同载体蛋白对免疫效价的影响  46-47
    3.5.4 免疫次数对免疫效价的影响  47-48
  3.6 本章小结  48-49
第四章 DES单克隆抗体的制备与鉴定  49-62
  4.1 引言  49
  4.2 试剂与仪器  49-51
    4.2.1 主要试剂  49-50
    4.2.2 主要仪器设备  50-51
  4.3 试验动物  51
  4.4 细胞  51
  4.5 试验方法  51-57
    4.5.1 试剂的配制  51-52
    4.5.2 细胞融合  52-53
    4.5.3 融合细胞的培养及阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆  53-54
    4.5.4 腹水型DES单克隆抗体的制备  54-55
    4.5.5 抗体亚型的鉴定  55
    4.5.6 腹水中抗体的纯化  55
    4.5.7 抗体蛋白含量的测定方法  55
    4.5.8 SDS-PAGE鉴定DES单抗  55
    4.5.9 DES单抗效价的测定和工作浓度的确定  55-56
    4.5.10 DES抑制标准曲线及半数抑制浓度IC_(50)的测定  56-57
    4.5.11 DES单抗亲和性的测定  57
    4.5.12 DES单抗特异性的测定  57
  4.6 结果与分析  57-61
    4.6.1 抗体亚型鉴定结果  57-58
    4.6.2 纯化后抗体蛋白浓度  58
    4.6.3 DES单抗的SDS-PAGE鉴定  58
    4.6.4 DES单抗效价和工作浓度  58-59
    4.6.5 DES抑制标准曲线及半数抑制浓度IC_(50)的测定  59-60
    4.6.6 DES单抗的亲和常数  60
    4.6.7 DES单抗特异性  60-61
  4.7 本章小结  61-62
第五章 DES免疫亲和层析柱的试制及其性能研究  62-68
  5.1 引言  62
  5.2 试剂与仪器  62-63
    5.2.1 主要试剂  62-63
    5.2.2 主要仪器  63
  5.3 试验方法  63-65
    5.3.1 DES单抗IAC柱的制备  63-64
    5.3.2 DES单抗IAC柱性能的试验研究  64
    5.3.3 DES的HPLC-MS检测方法的建立  64-65
  5.4 结果与分析  65-67
    5.4.1 DES标样的HPLC-MS检测  65-66
    5.4.2 DES的免疫亲和层析  66-67
  5.5 本章小结  67-68
第六章主要结论与展望  68-70
  6.1 主要结论  68
  6.2 工作展望  68-70
参考文献  70-76
致谢  76-77
在读学位期间发表的论文  77

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