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构树遗传多样性的AFLP研究

作　者: 周敏
导　师: 何承忠
学　校: 西南林学院
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 构树遗传多样性 AFLP 聚类分析
分类号: S792.990.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 144次
引　用: 3次
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内容摘要

构树(Broussonetia papyrifera)主要分布于我国的西北、华北、华南、东南及西南各地,构树适应性广,萌芽力强,易繁殖,是路旁绿化与防堤护岸的重要树种。其树皮、木材、枝桠、叶、花、果实、种子、根、乳汁等皆可综合利用,经济效益潜力很大。构树属植物近20年来广受国内外学者的关注。AFLP(扩增长度片段多态性)是一种新的DNA分子标记技术,以其稳定性好、重复性高、覆盖面广、多态检出率高等优点被迅速且广泛地运用于生命科学的各领域中。本研究首次采用AFLP分子标记技术研究构树种质资源遗传多样性、遗传结构及群体间的相互关系,并结合分布区的生境状况,探讨其遗传多样性和遗传分化的影响因素,为构树基因资源引进、评价、保存及遗传改良提供科学依据。主要结论如下:(1)本研究采用云南省内的296个构树种质为材料。通过对常规SDS法、常规CTAB法、SDS-CTAB结合法、改良CTAB和改良SDS法等多种提取方法对构树总DNA的提取效果进行比较研究,确定了改良SDS法较为适合构树基因组DNA的提取。此法提取的DNA其OD260/OD280值在1.8-2.0之间,且能被EcoRI和MseI酶切完全,并能获得清晰AFLP指纹图谱。此DNA提取方法快速、高效、经济,提取的DNA质量好,特别对样品数量多、工作量大等情况下的研究尤为适用。(2)通过对影响AFLP技术体系的各主要因素的研究,建立起适合构树的AFLP分析的技术体系:酶切体系30μL,总体积中含纯化后的DNA 4μL;EcoRI和MseI各5U,分步进行酶切;酶切完成后加入连接液,37℃连接过夜(10-12h);预扩增产物稀释40倍用于选择性扩增;扩增产物加入4μL的双指示剂,95℃变性5min后,在6%变性聚丙烯酰胺上恒功率(95W)进行电泳,然后进行银染显色。(3)从64对EcoRI /MseI引物中筛选出13对清晰、多态性高的引物,对296个构树材料的遗传多样性进行了AFLP分析,都得到了清晰的指纹图谱,并且表现出较好的多态性。利用7对引物对不同水系与不同家系的构树遗传多样性进行了研究,7对引物共扩增出786条带,平均每对引物扩增112.3条带,多态性条带632条,占总带数的80.4%。扩增片段大小在50-450bp之间。多态性最高的为引物组合E64/M54,高达86.4%,最低的是E40/M34,多态性为75.9%。利用6对引物对不同类型构树遗传多样性进行了研究,6对引物共扩增出831条带,平均每对引物扩增138.5条带,多态性条带610条,占总带数的73.4%。扩增片段大小在80-500bp之间。多态性最高的为引物组合E64/M54,高达86.4%,最低的是E44/M60,多态性为67.1%。揭示了构树种质具有丰富的遗传多样性。(4)对指纹图谱进行判读,构建0、1数学矩阵。利用POPGENE32 version 1.32软件计算遗传多样性指数,采用NTSYS.pc2.11f计算软件,得到相似性系数矩阵,并基于Nei’s遗传距离采用UPGMA法进行聚类分析。(5)在构树不同层次遗传多样性比较中,不同类型的遗传多样性最高,h=0.1706;而不同水系的遗传多样性最低,h=0.1328。居群内的遗传变异远高于居群间的遗传变异,居群间分化程度低。并且不同层次的基因流值都大于2,说明基因交流防止了由遗传漂变等引起的居群间的遗传分化。(6) 4个水系的遗传距离分析表明,以元江水系和金沙江水系之间的遗传距离最大(0.0098),元江水系与怒江水系、红河水系之间的遗传距离最小(0.0055)。从聚类图上可以看出,在遗传距离为0.003处取一结合线,可以将4个水系分为2大类,第一类包括元江水系、怒江水系和红河水系;第二类为金沙江水系。(7) 10个家系的遗传距离分析表明,以石屏家系I和江川家系之间的遗传距离最大(0.0373),四川家系I和四川家系II遗传距离最小(0.0030)。从聚类图上可以看出,在遗传距离为0.008处取一结合线,可以将10个家系分为2大类,第一个类包括怒江家系I,怒江家系II,怒江家系III,石屏家系I,石屏家系II,建水家系I;第二个类包括建水家系II,四川家系I,四川家系II,江川家系。(8) 4个构树类型的遗传距离分析表明,以青构和白花构之间的遗传距离最大(0.0296),红构和白花构遗传距离最小(0.0087)。从聚类图上可以看出,在遗传距离为0.006处取一结合线,可以将4个构树分为2大类,第一类包括红花构和青构;第二类包括红构和白花构。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
引言  12-14
1 文献综述  14-32
  1.1 遗传多样性概念及研究意义  14-16
  1.2 遗传变异的产生机理  16-18
  1.3 遗传多样性的研究方法  18-22
  1.4 各种DNA 分子标记技术的原理及特点  22-25
  1.5 AFLP 标记的原理及特点  25-27
  1.6 构树概述  27-28
  1.7 构树研究现状  28-29
  1.8 研究的目的意义  29-30
  1.9 研究思路与技术路线  30-32
2 材料与方法  32-41
  2.1 材料  32
  2.2 主要的试剂与仪器  32-33
  2.3 试验方法  33-41
    2.3.1 DNA 模板的制备  33-35
    2.3.2 酶切与连接  35-36
    2.3.3 预扩增  36-37
    2.3.4 选择性扩增  37-38
    2.3.5 引物对的筛选  38
    2.3.6 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳  38-40
    2.3.7 数据统计与分析  40-41
3 结果与分析  41-57
  3.1 适用于构树的AFLP 体系的建立  41-44
    3.1.1 DNA 提取的检测  41-42
    3.1.2 限制性内切酶酶切与连接  42
    3.1.3 预扩增  42-43
    3.1.4 选择性扩增  43-44
  3.2 不同水系构树遗传多样性AFLP 分析  44-48
    3.2.1 7 对引物对4 个水系构树样本的扩增结果  44-45
    3.2.2 4 个水系遗传多样性分析  45-47
    3.2.3 4 个水系聚类分析  47-48
  3.3 不同家系遗传多样性分析  48-53
    3.3.1 7 对引物对10 个家系构树样本的扩增结果  48-50
    3.3.2 10 个家系聚类分析  50-51
    3.3.3 由各家系材料组建不同种源样本分析结果  51-53
  3.4 不同构树类型的AFLP 分析  53-57
    3.4.1 6 对引物对4 个构树类型样本的扩增结果  53
    3.4.2 4 个构树类型遗传多样性分析  53-55
    3.4.3 4 个构树类型的聚类分析  55-57
4 讨论  57-66
  4.1 AFLP 的高效性和多态性  57
  4.2 影响实验结果的因素  57-61
    4.2.1 DNA 的提取  57-58
    4.2.2 内切酶的选择和组合  58
    4.2.3 酶切体系的建立  58-59
    4.2.4 预扩增稀释倍数的确定  59
    4.2.5 选择性扩增稀释倍数的确定  59-60
    4.2.6 银染过程中的问题  60-61
  4.3 构树遗传多样性探讨  61-66
    4.3.1 关于构树的遗传多样性  61-62
    4.3.2 不同地理居群构树遗传多样性分析  62
    4.3.3 不同类型构树遗传多样性分析  62-63
    4.3.4 构树不同层次遗传变异的比较  63-66
5 结论  66-67
参考文献  67-77
研究生期间发表的论文  77-78
致谢  78

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