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利迪链霉菌初级代谢关键基因的克隆与功能分析

作　者: 周雍进
导　师: 赵广荣
学　校: 天津大学
专　业: 生物化工
关键词: 利迪链霉菌初级代谢 PCR 木酮糖激酶基因葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因葡萄糖激酶基因磷酸果糖激酶基因异柠檬酸脱氢酶基因
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

利迪链菌素是利迪链霉菌产生的一种结构全新、抑菌效果明显的新型抗生素,具有很高的潜在应用价值。然而利迪链菌素的产量低是其应用的限制因素,加强初级代谢途径,提高其产量是一条可行的途径。本文克隆了利迪链霉菌初级代谢的几个关键基因,并进行了功能分析。研究了利迪链霉菌对木糖的利用能力,结果表明利迪链霉菌能利用木糖作为唯一碳源,但生长比较缓慢。在低浓度葡萄糖培养基上,木糖对生长具有显著促进作用。从利迪链霉菌中克隆到了木糖代谢的关键基因木酮糖激酶编码基因xylB,长度为1446bp,编码481个氨基酸。这表明,虽然利迪链霉菌利用木糖效率低,但仍然具有木糖代谢的遗传基础。采用同源克隆策略,克隆了利迪链霉菌葡萄糖代谢途径中的4个基因。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf2,长度1542bp,编码513个氨基酸,在242-252位具有AXXXGXGGXA (可能的NADP+结合位点)结构域,43位具有保守残基K(可能的葡萄糖-6-磷酸结合位点)。葡萄糖激酶编码基因glkA,长度954bp,编码317个氨基酸。磷酸果糖激酶基因pfkA1,长度1026bp,编码341个氨基酸。XylB,GlkA,PfkA1属于糖激酶,基于广义酸碱催化机理分析,催化活性区域可能分别为PYLDGERT (326-333位), CXCGXGCXEXY (168-180),DIXXTDXTXTFGFD (125-140位)。异柠檬酸脱氢酶基因idh长2220bp,编码739个氨基酸,Idh催化活性区域可能是HLKATMM(254-260位)。构建了zwf2组成型强表达载体,通过接合转移,将其转化到利迪链霉菌中。经过筛选鉴定,得到了重组利迪链霉菌。通过以上糖代谢关键基因克隆与功能分析研究,并构建了zwf2高表达菌株,为以后深入研究初级代谢对利迪链菌素生物合成的影响奠定了基础。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
前言  8-9
第一章文献综述  9-22
  1.1 链霉菌及利迪链菌素  9-11
    1.1.1 链霉菌  9-10
    1.1.2 利迪链菌素  10-11
  1.2 提高微生物目标产物产量的遗传学方法  11-14
    1.2.1 随机筛选法  11
    1.2.2 推理选育法  11-12
    1.2.3 原生质体融合技术  12-13
    1.2.4 核糖体工程  13-14
  1.3 代谢工程途径改造  14-20
    1.3.1 代谢工程  14
    1.3.2 利用代谢工程组合生物合成新型抗生素  14-15
    1.3.3 改造次级代谢途径提高抗生素产量  15-17
    1.3.4 改造初级代谢途径提高抗生素产量  17-20
  1.4 本文的研究意义和主要研究内容  20-22
第二章利迪链霉菌中木糖代谢的初步研究  22-39
  2.1 材料和方法  22-29
    2.1.1 菌种  22
    2.1.2 主要试剂和仪器  22-23
    2.1.3 利迪链霉菌培养  23
    2.1.4 大肠杆菌的培养  23-24
    2.1.5 利迪链霉菌生长曲线的测定  24
    2.1.6 利迪链霉菌在不同碳源上生长量的测定  24
    2.1.7 链霉菌染色体DNA的提取  24-25
    2.1.8 基因克隆的PCR反应  25-26
    2.1.9 PCR体系中目的片断的回收  26
    2.1.10 琼脂糖凝胶电泳  26
    2.1.11 T载体连接反应  26
    2.1.12 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备  26-27
    2.1.13 转化反应与蓝白筛选  27
    2.1.14 菌落PCR  27-28
    2.1.15 碱裂解法提取质粒  28
    2.1.16 酶切验证  28-29
    2.1.17 DNA序列的测定  29
    2.1.18 同源克隆的克隆策略和引物设计  29
    2.1.19 对木酮糖激酶 XylB 基因进行分析  29
  2.2 结果与讨论  29-38
    2.2.1 利迪链霉菌的生长曲线  29-30
    2.2.2 以木糖为单一碳源木糖量对链霉菌生长的影响  30-31
    2.2.3 木糖和葡萄糖混合碳源对链霉菌生长的影响  31-32
    2.2.4 木糖代谢途径和糖酵解途径的关系  32-33
    2.2.5 克隆木酮糖激酶编码基因xylB及功能分析  33-38
  2.3 小结  38-39
第三章利迪链霉菌葡萄糖代谢关键基因的克隆与功能分析  39-62
  3.1 材料和方法  39-41
    3.1.1 菌种  39
    3.1.2 生化试剂和仪器  39
    3.1.3 初级代谢基因的克隆  39
    3.1.4 同源克隆的克隆策略和引物设计  39-40
    3.1.5 序列分析  40-41
  3.2 结果与讨论  41-61
    3.2.1 克隆葡萄糖-6-磷酸编码基因zwf2 与功能分析  41-46
    3.2.2 克隆葡萄糖激酶编码glkA与功能分析  46-51
    3.2.3 克隆磷酸果糖激酶激酶编码基因pfkA1  51-55
    3.2.4 克隆异柠檬酸脱氢酶编码基因idh  55-61
  3.3 小结  61-62
第四章高表达zwf2 工程菌株的构建  62-69
  4.1 材料和方法  62-65
    4.1.1 菌种和质粒  62
    4.1.2 生化试剂和仪器  62
    4.1.3 ET12567(pUZ8002) 感受态细胞的制备  62-63
    4.1.4 zwf2 基因引物的重新设计  63
    4.1.5 PCR zwf2(链霉菌表达)基因  63
    4.1.6 PCR产物,酶切产物纯化  63
    4.1.7 强组成型表达载体与zwf2 的连接  63-64
    4.1.8 接合转移供体菌的构建与验证  64
    4.1.9 zwf2 基因结合转移  64-65
  4.2 结果与讨论  65-68
    4.2.1 zwf2 的PCR结果  65-66
    4.2.2 zwf2 组成型强表达型载体构建  66-67
    4.2.3 ET12567-pIB139-zwf2 的确认  67-68
    4.2.4 结合转移菌株的筛选  68
  4.3 小结  68-69
第五章结论与展望  69-71
  5.1 主要结论  69
  5.2 展望  69-71
参考文献  71-77
发表论文和参加科研情况说明  77-78
致谢  78

利迪链霉菌初级代谢关键基因的克隆与功能分析

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