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猪性别控制精液生产中抗分离损伤的研究

作　者: 夏春梅
导　师: 张林波
学　校: 吉林农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 猪精子分离活力顶体获能人工授精
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本实验研究了猪性别控制精液生产过程中流式细胞仪相关分离参数的筛选,并通过荧光染色法,对分离精子的活力、顶体完整率和获能情况进行检测,来评价流式细胞仪分离处理对猪精子生理机能的影响,并通过添加抗氧化剂加以改善；研究应用添加抗氧化剂AA-2G后,猪精子人工授精效果。实验的目的是探索性控精液受精能力下降的原因,为进一步改善相关辅助生殖技术奠定基础。实验分为四部分：第一部分通过调节流式细胞仪,筛选出适宜猪精子分离的染料浓度和分离压力。结果表明,流式细胞仪分离猪精子过程中,当荧光染料H33342浓度为17.78-36.67μM,分离压力在40.2-40.8psi时,猪精子能够得到有效地分离。第二部分采用荧光染色法结合激光共聚焦显微镜,检测通过添加不同抗氧化剂后的猪分离精子的相关生理指标,研究不同抗氧化剂对精子的保护作用,进而筛选出最佳抗氧化剂。结果表明,A组(AA-2G)及P+A组(添加10%精清和AA-2G)的精子活力与其他组相比均明显提高(活力分别为0.87和0.85),并且差异显著(P<0.05)；抗氧化剂AA-2G能够明显延长分离精子的存活时间(4.5h以上)。第三部分采用荧光染色法结合激光共聚焦显微镜以及彩色精子质量检测系统,检测添加抗氧化剂AA-2G后的猪分离精子的相关生理指标,研究适宜猪精子的最佳AA-2G的浓度,以及其对猪精子的保护作用。结果表明,CASA进行猪分离精子动态分析,AA-2G浓度为200μM时,前向性(STR)、平均路径速度(VAP)侧摆幅度(ALH)与对照组及其他各浓度组差异显著(P<0.05)。在此浓度17℃体外培养5h和6h时,抗氧化剂组和不添加抗氧化剂的对照组分离精子活力分别为0.45% vs 0.38%,0.38% vs 0.30%,两组差异极其显著(P<0.01)；此时分离精子在体外培养3h以前,添加抗氧化剂组与对照组的精子顶体完整率均无显著性差异。培养4h时,抗氧化剂相对对照组显著提高了精子的顶体完整率(60.4% vs 46.0%)(P<0.05),同时,随着体外培养时间的延长,各组精子顶体完整率呈下降趋势,不添加抗氧化剂组下降明显(80.2% vs 37.2%)。体外培养4h后,添加抗氧化剂AA-2G组和对照组精子的获能百分率分别为40.6% vs 47.2%,两组差异显著(P<0.05),6h时分别为45.2% vs 58.8%,两组差异极显著(P<0.01)。第四部分利用猪分离精子进行人工授精试验,并通过添加抗氧化剂AA-2G来研究其对猪精子人工授精效果的影响。试验结果表明,猪性别控制精液人工授精妊娠率为63.64%(21/33),X精子分离准确率为95.35%(82/86),Y精子分离准确率为99.17%(120/121)。当抗氧化剂AA-2G存在时,分离2h后进行人工授精(AI),添加抗氧化剂组妊娠率达61.02%；而对照组为59.26%。并且添加抗氧化剂组在24小时后进行人工授精,妊娠率能达到不添加抗氧化剂进行分离后立即输精的妊娠率水平(59.25 vs 59.26),充分说明抗氧化剂能有效延长猪分离精子存活时间。结论：在荧光染料H33342浓度为17.78-36.67μM,分离压力在40.2-40.8psi时,猪精子能够得到有效地分离,通过添加抗氧化剂AA-2G对猪性别控制精液的精子活力、顶体完整性、质膜完整性以及存活时间(A组或P+A组)都有明显的提高作用。应用CASA进行猪分离精子动态分析显示,适合猪精子分离的最佳AA-2G浓度为200μM,且在此浓度下AA-2G能显著提高猪分离精子17℃体外培养活力、顶体完整率,降低获能百分率。并能有效提高猪分离精子人工授精的妊娠率。为猪性别控制精子的商业化推广奠定了理论基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
缩略语  9-10
第一章文献综述  10-24
  第一节流式细胞仪分离精子技术的研究进展  10-16
    1.1 流式细胞仪分离精子技术的历史  10-13
    1.2 流式细胞仪分离精子的原理  13-14
    1.3 精子分离的准确性与有效性评估  14-15
    1.4 流式细胞仪精子分离法的局限性和应用前景  15-16
  第二节精子氧化应激损伤机制及抗氧化剂在哺乳动物精子上的应用进展  16-23
    2.1 精子中氧化应激的发生机制  16-17
    2.2 影响精子的活性氧的来源  17-18
    2.3 活性氧对精子的作用  18-19
    2.4 脂质过氧化及其对精子机能的影响  19
    2.5 氧化应激的测定  19-20
    2.6 氧化应激的防御机制及抗氧化剂在精子上的应用进展  20-22
    2.7 目前关于氧化应激和抗氧化剂的研究现状  22-23
  第三节本实验目的及意义  23-24
第二章研究论文  24-38
  第一节流式细胞仪分离猪精子分离参数的设定  24-26
    1.1 材料与方法  24-25
    1.2 结果与分析  25-26
  第二节添加不同抗氧化剂对猪分离精子相关生理指标的影响  26-30
    2.1 材料与方法  26-29
    2.2 结果与分析  29-30
  第三节抗氧化剂AA-2G在猪精子分离过程中的抗损伤作用  30-35
    3.1 材料与方法  30-31
    3.2 结果与分析  31-35
  第四节猪分离精液的人工授精实验研究  35-38
    4.1 材料与方法  35-36
    4.2 结果与分析  36-38
第三章讨论  38-40
第四章结论  40-41
参考文献  41-46
致谢  46-47
作者简介  47

猪性别控制精液生产中抗分离损伤的研究

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