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单壁碳纳米管诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡机制的研究

作　者: 程文文
导　师: 丁书茂；袭著革
学　校: 华中师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 单壁碳纳米管 细胞凋亡 大鼠主动脉内皮细胞 活性氧族 氧化损伤 线粒体途径
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


单壁碳纳米管(single walled carbon nanotubes SWCNTs)的应用日益广泛,前景非常可观,在现代工农业生产以及科研应用中都起着非常重要的作用,所以,其安全性是一个必须要注意的问题。目前,有关单壁碳纳米管的生物毒性效应的研究较多,但是,有关单壁碳纳米管与心血管疾病之间的联系的相关研究却很少,于是,选取内皮细胞作为靶细胞来进行研究,首先对单壁碳纳米管所致的内皮细胞氧化损伤的进行深入的研究,全面的探讨了单壁碳纳米管导致的大鼠主动脉内皮细胞的氧化损伤；然后,试图以氧化损伤作为出发点,研究单壁碳纳米管导致的大鼠主动脉内皮细胞凋亡的分子机制和信号通路。在单壁碳纳米管所致的氧化损伤的研究中,分别从细胞水平到分子水平再到蛋白质水平来进行深入的探讨,即：活性氧族(ROS)、非酶类抗氧化物谷胱甘肽(GSH)、脂质过氧化物丙二醛(MDA)、酶类抗氧化物超氧化物歧化酶(SOD)、DNA损伤DNA-蛋白质交联以及单细胞凝胶电泳(DPC、单细胞凝胶电泳)、蛋白质损伤(蛋白质羰基化)、炎症因子(TNFα)、抗氧化蛋白(HO-1)等方面进行相对全面的研究,我们发现,随着单壁碳纳米管暴露的剂量和时间的不断增加,大鼠主动脉内皮细胞内活性氧族的含量会逐渐增加,抗氧化物(GSH、SOD)的含量会被逐渐消耗,DNA损伤(DPC、单细胞凝胶电泳)程度会逐渐加重以及蛋白质损伤(蛋白质羰基化)程度逐渐加剧,TNFα的表达逐渐增加、抗氧化蛋白的表达随之上调。在单壁碳纳米管诱导的细胞凋亡的研究中,试图通过对不同蛋白表达的检测明确细胞凋亡的分子机制。通过大量的实验数据和研究结果发现单壁碳纳米管作用于大鼠主动脉内皮细胞后,可以导致活性氧族在细胞内的不断积累,活性氧族的不断堆积导致了氧化损伤的加剧最终诱发了线粒体途径的细胞凋亡。通过荧光显微镜和电镜观察了细胞的细胞结构和亚细胞结构的变化、Caspase-3活化、NF-KB、P53、Caspase-3蛋白、BAX蛋白、AIF蛋白、细胞色素C蛋白的调控。总之,实验结果显示：单壁碳纳米管所诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡的分子信号通路是由活性氧族参与和激发的线粒体细胞信号通路。

全文目录


中文摘要  4-5
Abstract  5-9
1. 文献综述  9-16
  1.1 纳米材料的研究现状  9-13
    1.1.1 纳米材料概述  9
    1.1.2 纳米材料安全性的相关研究  9-11
    1.1.3 单壁碳纳米管对心血管疾病方面的相关研究情况  11
    1.1.4 单壁碳纳米管诱导活性氧族的堆积导致氧化损伤和细胞凋亡的研究  11-13
  1.2 项目立题依据  13-16
    1.2.1 纳米材料与心血管系统之间的联系以及其造成的危害  13-14
    1.2.2 单臂碳纳米管是研究心血管系统毒性作用的典型纳米材料  14-16
2. 材料与方法  16-21
  2.1 实验材料  16
    2.1.1 纳米材料  16
  2.2 实验方法  16-21
    2.2.1 细胞培养  16
    2.2.2 单壁碳纳米管的分散  16
    2.2.3 甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐),WST-8测定细胞存活率  16-17
    2.2.4 活性氧族的检测  17
    2.2.5 谷胱甘肽的检测  17
    2.2.6 一氧化氮合酶的检测  17
    2.2.7 DNA-蛋白质交联的分析  17-18
    2.2.8 非变聚丙烯酰胺凝胶电泳  18
    2.2.9 高效液相色谱法测定丙二醛  18
    2.2.10 单细胞凝胶电泳  18
    2.2.11 蛋白质羰基化的测定  18
    2.2.12 线粒体势能的检测  18-19
    2.2.13 Casepase-3活性的检测  19
    2.2.14 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡的分析  19
    2.2.15 细胞周期的测定  19
    2.2.16 逆转录PCR反应  19
    2.2.17 免疫荧光  19-20
    2.2.18 免疫印记  20
    2.2.19 凋亡细胞形态荧光显微镜以及扫描电镜的检测  20
    2.2.20 数据分析  20
    2.2.21 实验仪器  20-21
3. 实验结果  21-33
  3.1 细胞存活率的检测  21
  3.2 活性氧族(ROS)、谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮合酶(NOS)的检测  21-24
  3.3 DNA-蛋白质交联的分析  24
  3.4 非变聚丙烯酰胺凝胶电泳  24
  3.5 高效液相色谱法测定丙二醛  24-25
  3.6 单细胞凝胶电泳  25-26
  3.7 蛋白质羰基化的测定  26
  3.8 线粒体势能的检测  26-27
  3.9 CASEPASE-3活性的检测  27
  3.10 ANNEXIN V-FITC/PI细胞凋亡的分析  27
  3.11 细胞周期的测定  27-29
  3.12 逆转录PCR反应  29
  3.13 免疫荧光和免疫印记  29-30
  3.14 凋亡细胞形态观察扫描电镜的检测  30-33
4. 讨论  33-39
  4.1 单壁碳纳米管对细胞存活率的影响  33
  4.2 ROS的检测和GSH的测定  33-34
  4.3 DNA-蛋白质交联的研究  34
  4.4 单壁碳纳米管氧化损伤的研究  34-35
  4.5 线粒体膜势能的检测  35-36
  4.6 CASPASE-3活性的检测  36
  4.7 细胞周期的检测  36-37
  4.8 ANNEXIN V-FITC/PI细胞凋亡的检测  37
  4.9 P53依赖的线粒体途径细胞凋亡  37-39
5. 结论  39-40
参考文献  40-48
致谢  48-49
附录  49-58

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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