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siRNA干扰预防酒精性股骨头坏死的动物实验研究

作　者: 张林锋
导　师: 王义生
学　校: 郑州大学
专　业: 外科学
关键词: RNA干扰预防酒精性股骨头坏死家兔
分类号: R681.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景和目的：酒精性股骨头坏死(Osteonecrosis of the femoral head, ONFH)在临床上常见,早期症状隐匿,容易被忽视,当髋部疼痛不适就诊时,股骨头病变往往发展为ARCOⅡ期或Ⅱ期以上,失去了治疗的最佳时期,该病致残率高,严重威胁着人类的健康,迄今没有发现有效预防该病发生的方法。最新的酒精性股骨头坏死发病机理动物实验表明,过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)基因在动物股骨头内的多潜能干细胞骨髓基质细胞(marrow stromal cells, MSCs)成脂分化过程中起着关键性的调节作用,长期大量的酒精摄入可明显上调PPARγ基因表达,促进MSCs成脂分化,抑制其成骨分化,引起股骨头内脂肪细胞数目增多、体积增大、脂质沉积、骨细胞变性坏死。本研究运用RNA干扰(RNA interference, RNAi)原理,将经过筛选、鉴定并体外扩增的高效siRNA腺病毒载体注入家兔的股骨头内,观察siRNA腺病毒预防酒精性ONFH的效果,从基因方面寻求一种防治酒精性股骨头坏死的有效途径。材料和方法：选取健康新西兰种家兔96只,2～3月龄,体重2.7±0.5/只,雌雄不拘,随机分为4组,每组24只。正常对照组(N组)：采用灌胃法,给予10%葡萄糖注射液10ml/(kg·d);酒精组(M组)：采用灌胃法,给予白酒(酒精度含量46%V/V)10ml/(kg·d),作为股骨头坏死模型组；酒精+重组腺病毒组(S组)：同法同量灌酒,在实验第1、3、5月的第1天随机选择侧别麻醉下经股骨颈行股骨头穿刺,注入25μl siRNA腺病毒滴液,用骨蜡封闭穿刺小孔。酒精+穿刺组(CO组)：手术方法同S组,但不注入siRNA腺病毒载体。各组动物分别于实验第2、4、6月月末测定空腹血清总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)含量；观察各组动物股骨头组织学变化；测定各组股骨头组织中的最大脂肪细胞平均直径、骨小梁面积分数和空骨陷窝计数。采用RT-PCR技术检测各组股骨头组织中PPARγmRNA和Osteocalcin mRNA的表达。Western-blot检测各组股骨头内PPARγ蛋白表达。结果：1.一般状况：在整个实验期间,N组食欲正常,动作敏捷,体重逐渐增加；M、CO两组随酒精灌胃时间延长食欲逐渐下降,活动量减小,动作迟缓,体重增长不明显,精神欠佳,皮毛发黄、晦涩、失去光泽；S组精神、食欲、体重增长及动作灵活性优于M、CO组,但较N组稍差。2.各组实验动物各时间段空腹血清甘油三酯(TG)和总胆固醇(CHO)含量变化(mmol/L):实验第2、4、6个月M、CO、S组动物空腹TG、CHO测定结果明显高于N组水平,且随实验进展呈逐渐增高趋势,与N组比较差异有统计学意义(P<0.05)；股骨头组织病理学HE染色、苏丹Ⅲ脂肪染色显示M、CO组股骨头内空骨陷窝计数、脂肪细胞及最大脂肪细胞平均直径明显增多、增大,骨小梁稀疏、变细,相对N、S组差异有统计学意义(P<0.05),S组空骨陷窝计数、脂肪细胞及最大脂肪细胞平均直径未见明显增加(P>0.05),相对N组差异无统计学意义。3.股骨头骨髓细胞成脂、成骨分化基因检测结果：RT-PCR检测股骨头骨髓细胞中PPARγmRNA和Osteocalcin mRNA基因表达、Western-blot检测股骨头骨髓细胞PPARγ蛋白表达结果显示M、CO组股骨头内PPARγmRNA基因、PPARγmRNA蛋白相对β-actin的吸光度比值明显增高,Osteocalcin mRNA基因相对β-actin的吸光度比值明显降低,与N、S组差异均有统计学意义(P<0.05),S组中PPARγmRNA基因、PPARγmRNA蛋白相对β-actin的吸光度比值和Osteocalcin mRNA基因相对β-actin的吸光度比值相对N组差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1.长期大量的酒精摄入可以导致酒精性股骨头缺血坏死。2. pAdeno-X-siPPARγ重组腺病毒能够有效阻断PPARγmRNA的表达,阻止酒精诱导家兔活体股骨头内MSCs成脂分化,保持其成骨分化,促进新骨形成、骨修复和功能重建。3.应用RNAi技术,可以从家兔酒精性股骨头坏死发病机制上防治其发生,对酒精性ONFH的防治提供了新的技术路线和科学的理论依据,其长期疗效及以后的临床应用有待进一步观察和研究。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-13
siNRA干扰预防酒精性股骨头坏死的动物实验研究  13-66
  引言  13-15
  1. 材料与方法  15-21
    1.1 材料  15
    1.2 方法  15-21
  2. 结果  21-59
    2.1 一般情况观察  21
    2.2 血清学检测  21-25
    2.3 股骨头组织病理学  25-45
    2.4不同时期各组股骨头中PPRAYmNRA和骨钙素mRAN基因表达  45-54
    2.5 不同实验时期Wseetrn-blto检测各组股骨头中PPARr蛋白表达  54-59
  3 讨论  59-63
    3.1 酒精性股骨头坏死的病因及发病机制  59-60
    3.2 RNA干扰(RNA interference,RNAi)及其作用机理  60
    3.3 RNA干扰预防酒精性股骨头坏死  60-63
  4 结论  63-64
  参考文献  64-66
综述酒精性股骨头缺血坏死的研究进展  66-85
  1、长期大量的酒精摄入与非创伤性股骨头缺血坏死之间关系密切  66-67
  2、酒精性股骨头坏死的组织病理学变化  67-69
  3、酒精性ONFH的发病机理  69-74
  4 酒精性ONFH的分期与诊断  74-75
  5 酒精性ONFH的治疗  75-79
  6 展望  79-80
  参考文献  80-85
个人简历  85-86
在学期间发表论文  86-87
致谢  87

siRNA干扰预防酒精性股骨头坏死的动物实验研究

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