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小分子化合物在诱导山羊iPS细胞中的作用

作　者: 孟书燕
导　师: 王华岩
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 山羊 iPS细胞小分子化合物心肌样细胞诱导分化
分类号: Q952
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

动物胚胎干细胞(ES)为研究早期胚胎发育、基因打靶、动物克隆和再生医学提供了种子细胞。但是,由于取材困难,培养条件不稳定等因素,大动物ES细胞的研究还面临很多困难。目前,人们发现通过导入外源多能性转录因子,可使体细胞重编程为多能状态,产生的细胞被称为诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)。iPS细胞的出现可避开ES细胞的困难,从而产生一种可代替ES细胞的多能干细胞。iPS细胞系已经相继在小鼠、人、恒河猴、大鼠、猪、兔、绵羊、山羊等动物中建立。本研究主要探讨小分子化合物对产生iPS细胞的影响。1、小分子化合物对p-giPS细胞的重编程影响本实验中,通过使用携带有小鼠多能性四因子Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc的逆转录病毒载体,转染山羊胎儿成纤维细胞(goat embryonic fibroblasts,GEF),在体外诱导培养后,得到山羊诱导多能性干细胞(goat induced pluripotent stem cells,giPS cells)。这些细胞具有扁平的人ES细胞样的形态,边缘整齐,细胞的核质比较大,AP检测阳性;能在体外长期培养,稳定传代,并且保持克隆形态不变;此外这些细胞还表达内源性多能因子Nanog,Sox2和TERT等基因,也表达阶段特异性表面抗原SSEA-4,不表达SSEA-1,TRA-1-60和TRA-1-81。但是这些细胞持续表达外源因子,不表达关键的多能因子Oct4基因,也不能在裸鼠体内形成畸胎瘤,因此我们认为这些细胞是部分重编程的多能细胞(partial goat induced pluripotent stem cells,p-giPS cells)。在诱导细胞重编程过程中,由于内源多能性因子的激活是随机性的,因此重编程的效率比较低,会产生大量的不完全重编程的细胞。而添加小分子化合物可促进细胞重编程的效率,使部分重编程细胞转变为完全重编程细胞。我们在山羊部分重编程细胞的培养液中添加小分子维生素C(Vc)和5-Aza-2′-Deoxycytidine (5-AzadC),结果发现添加小分子的实验组与对照组比较,其内源多能性因子Nanog,Sox2和TERT的表达量分别提高了4倍,6倍和10倍。但是,内源Oct4因子的表达未见上调,而且外源四因子的表达也未沉默。这一结果说明Vc和5-AzadC两种小分子能在一定程度上提高内源多能因子的表达水平,但未使之彻底转变为完全重编程细胞。2、p-giPS细胞向心肌样细胞的诱导分化本实验得到的p-giPS细胞具有多分化潜能,可在体外分化成为心肌样细胞,这些细胞表达心肌标记基因Nkx2.5,Gata-4,α-MHC和TNNi3。添加Vc和5-AzadC组的细胞与对照组相比,也具有分化为心肌样细胞的能力,但Nkx2.5,Gata-4和TNNi3的表达量在三种处理中有所不同,免疫荧光也显示三种处理下的细胞都表达Nkx2.5。上述结果说明,通过四因子诱导产生的山羊部分重编程细胞表达一些多能标记基因,但不是完全具有多能性,添加小分子Vc和5-AzadC后能提高多能性基因的表达水平,同时还具有分化为心肌样细胞的能力,这可为进一步研究山羊iPS细胞的发生过程提供帮助,从而有助于建立山羊ES细胞系和产生基因修饰的山羊。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-13
文献综述  13-27
  第一章细胞重编程的研究  13-19
    1.1 核移植  14-15
    1.2 细胞融合  15
    1.3 诱导多能性干细胞  15-19
      1.3.1 重编程机制的研究  16-17
      1.3.2 诱导方法的改进  17
      1.3.3 动物模型  17-18
      1.3.4 完全多能性  18
      1.3.5 未来的研究方向  18
      1.3.6 结论  18-19
  第二章小分子化合物对诱导重编程的影响  19-24
    2.1 microRNA 在重编程过程中的潜在作用  19-20
    2.2 小分子化合物参与重编程  20-24
      2.2.1 天然化合物维生素C（vitamin C，Vc）  21
      2.2.2 DNA 甲基转移酶抑制剂AZA 和5-AzadC  21
      2.2.3 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 VPA,TSA 和SAHA  21-22
      2.2.4 MEK 和GSK3 信号通路抑制剂  22-23
      2.2.5 TGF-β通路抑制剂  23
      2.2.6 未来研究方向  23-24
  第三章干细胞向心肌细胞分化的研究  24-27
    3.1 类胚体的形成和心肌细胞自发分化  24-25
    3.2 用特定的因子诱导心肌分化  25
    3.3 多能干细胞来源的心肌细胞的特征  25-26
    3.4 结论与未来的展望  26-27
试验研究  27-50
  第四章小分子化合物对p-giPS 细胞的重编程影响  27-42
    4.1 材料  28-29
      4.1.1 关中奶山羊胎儿  28
      4.1.2 细胞与质粒  28
      4.1.3 实验所用试剂  28
      4.1.4 仪器与设备  28
      4.1.5 溶液的配制  28-29
    4.2 方法  29-33
      4.2.1 山羊胎儿成纤维细胞的分离培养  29-30
      4.2.2 小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）的分离培养和饲养层细胞的制备  30
      4.2.3 逆转录病毒的包装和感染  30
      4.2.4 碱性磷酸酶（AP）染色  30-31
      4.2.5 细胞RNA 的提取  31
      4.2.6 PCR 反应  31-32
      4.2.7 qPCR  32
      4.2.8 细胞的免疫荧光检测  32
      4.2.9 软琼脂实验  32-33
    4.3 结果  33-40
      4.3.1 山羊诱导多能干细胞（giPS cells）的获得  33
      4.3.2 碱性磷酸酶（AP）染色  33
      4.3.3 RT-PCR 检测获得的giPS 细胞内外源因子的表达  33-34
      4.3.4 RT-PCR 和qPCR 检测小分子处理后p-giPS 细胞的内外源因子的表达  34-36
      4.3.5 AP 染色检测添加小分子后的p-giPS 细胞  36-37
      4.3.6 细胞免疫荧光检测  37-38
      4.3.7 软琼脂实验检测p-giPS 细胞体外增殖能力  38-40
    4.4 讨论  40-41
    4.5 小结  41-42
  第五章 p-giPS 细胞向心肌样细胞的诱导分化  42-50
    5.1 材料  42-44
      5.1.1 实验所用试剂  42-43
      5.1.2 仪器与设备  43
      5.1.3 溶液的配制  43-44
    5.2 方法  44-46
      5.2.1 p-giPS 细胞类胚体的形成  44
      5.2.2 p-giPS 细胞分化的心肌样细胞的RNA 提取  44
      5.2.3 PCR 反应  44-45
      5.2.4 qPCR  45-46
      5.2.5 细胞的免疫荧光检测  46
    5.3 结果  46-48
      5.3.1 p-giPS 细胞分化的心肌样细胞表达多种心肌标记基因  46-47
      5.3.2 q-PCR 分析心肌样细胞的标记基因的表达  47-48
      5.3.3 p-giPS 细胞分化为心肌样细胞的免疫荧光  48
    5.4 讨论  48-49
    5.5 小结  49-50
结论  50-51
论文创新点  51-52
参考文献  52-58
致谢  58-59
作者简介  59

小分子化合物在诱导山羊iPS细胞中的作用

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