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TSA浓度及处理时间对猪体细胞核移植胚胎体外发育及转基因eGFP表达的影响

作　者: 黄波
导　师: 刘忠华
学　校: 东北农业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: TSA 体细胞核移植体外发育猪
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

通过体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)技术路线已经成功获得多种哺乳动物转基因及非转基因克隆个体。然而,各物种的克隆效率仍不尽人意。近来有研究表明,表观遗传重编程(epigenetic reprogramming)在SCNT获得的克隆胚胎的发育过程中扮演着重要角色;人们认为重编程紊乱导致了大多数克隆胚胎的不正常发育。研究证明,组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)如曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)等的处理能显著增强多个物种SCNT胚胎的发育能力。为改善猪克隆胚胎的发育能力,本实验尝试优化了TSA处理参数,并检测了TSA对胚胎发育及转基因eGFP表达的影响。实验取得如下结果:对猪胎儿成纤维细胞构建的克隆胚胎分别采用0、20、40、60、80、100nM的TSA在激活后处理12h,结果显示40nM处理组的囊胚率为35.65±9.58%,显著高于其它各处理组及对照组的囊胚率(13.00±3.02%)(P<0.05)。40nM处理组发育至4-细胞期的胚胎数显著高于对照组(P<0.05),表明40nM TSA的处理可促进4-细胞期发生的合子基因激活(zygotic gene activation, ZGA)事件。40nM TSA处理重构胚12h和24h后,两处理组重构胚的囊胚发育率分别为16.32±1.51%和14.93±4.91%,二者差异不显著(P>0.05)。结果表明40nM TSA处理12h或24h均可提高猪SCNT胚胎体外发育能力。以猪骨髓间充质干细胞(PMSCs)、成纤维细胞(PFFs)和卵丘细胞(Cumulus)为核供体的重构胚分别以40nM的TSA在激活后处理12h,结果显示不同核供体来源的重构胚在TSA处理后的囊胚发育率分别为17.39±14.64%、12.65±4.82%和2.90±5.02%,与对照组相比均有所提高,但组间差异不显著(P>0.05)。将eGFP转基因成纤维细胞为核供体的猪重构胚分别采用0、20、40、60、80、100、120和140nM的TSA在激活后处理12h,结果显示TSA处理后组间的囊胚发育率差异不显著(P>0.05)。结果表明TSA可以提高不同供核细胞构建的重构胚的体外发育能力。以人包皮成纤维细胞为核供体猪卵母细胞为核受体的人猪异种核移植(human-porcine interspecies nuclear transfer, hp-ISNT)囊胚发育率为1.07±1.27%,显著低于孤雌组的囊胚发育率(21.06±5.92%)(P<0.05)。hp-ISNT重构胚4-细胞胚胎发育率为62.84±18.57%,显著低于孤雌组(87.13±4.42%)(P<0.05)。结果表明hp-ISNT胚胎发育率较低可能与4-细胞期的ZGA事件不完全发生有关。40nM TSA处理hp-ISNT重构胚24h,结果显示TSA处理组与对照组间异种重构胚的体外发育率无显著差异(分别为0.74±1.47%和1.07±1.27%)(P>0.05)。结果表明TSA不能显著改善hp-ISNT胚胎的体外发育能力。5nM TSA对供体细胞进行24h处理后,由其构建的重构胚的囊胚发育率为7.84±5.31%,显著低于对照组(对胚胎及细胞均不进行TSA处理)(P<0.05)。当供体细胞以5nM TSA处理24h,重构胚以40nM TSA处理24h后,重构胚的囊胚发育率为48.96±10.17%,显著高于对照组(P<0.05)。结果表明TSA可以明显改善eGFP转基因核移植胚胎的体外发育能力。对eGFP转基因体细胞核移植胚胎的eGFP基因表达进行荧光检测发现,第一细胞周期内的2h和12h明显可以观测到细胞核附近存在大量的eGFP蛋白。当胚胎发育至2～4-细胞期时细胞核区的eGFP蛋白丰度较1-细胞胚胎的低。随着胚胎发育至囊胚期,细胞核区的eGFP蛋白表达量较4-细胞胚胎有所增加。应用RT-PCR检测手段,我们对比了TSA对克隆胚胎eGFP基因表达的影响。当TSA对供体细胞进行处理(G2组)后,结果显示重构胚eGFP基因的mRNA表达水平较对照组(G1组)高(P<0.05)。但这两组eGFP表达趋势却相似,表现为随着胚胎的发育eGFP表达水平逐渐上升。当供体细胞与核移植胚胎均以TSA进行处理(G3组)后,1-细胞胚胎eGFP表达量与G2组无显著差异(P>0.05),但随着胚胎不断地发育,eGFP表达量逐渐下降至对照G1组水平。结果表明TSA可以改变转基因eGFP的表达水平。

全文目录

中文摘要  8-10
英文摘要  10-13
1 前言  13-27
  1.1 体细胞核移植技术研究简介  13-14
  1.2 体细胞核移植技术程序  14-19
    1.2.1 供体细胞的选择和准备  14-16
    1.2.2 受体细胞的选择和准备  16-17
    1.2.3 细胞核移植方法  17-18
    1.2.4 重构胚的激活  18-19
    1.2.5 重构胚的培养  19
  1.3 猪体细胞核移植效率研究进展  19
  1.4 体细胞核移植重编程与组蛋白乙酰化修饰  19-23
    1.4.1 组蛋白的乙酰化与去乙酰化  19-21
    1.4.2 重编程与组蛋白乙酰化  21-23
    1.4.3 外源转基因沉默与组蛋白乙酰化  23
  1.5 体细胞核移植技术的应用  23-26
    1.5.1 生殖性克隆  24
    1.5.2 治疗性克隆  24-26
  1.6 本研究的目的和意义  26-27
2 材料与方法  27-32
  2.1 实验材料  27-29
    2.1.1 猪卵巢  27
    2.1.2 试剂  27
    2.1.3 主要器材  27-28
    2.1.4 缓冲液及主要试剂的配制  28-29
  2.2 实验方法  29-32
    2.2.1 卵母细胞的采集  29
    2.2.2 卵母细胞的体外成熟  29
    2.2.3 核供体细胞的准备  29-30
    2.2.4 体细胞核移植  30
    2.2.5 重构胚药物处理与胚胎培养  30
    2.2.6 重构胚的体外发育统计与分析  30
    2.2.7 胚胎Hoechst 33342 染色及eGFP 观测  30
    2.2.8 胚胎eGFP 基因mRNA 表达的RT-PCR 分析  30-32
3 结果与分析  32-42
  3.1 不同浓度TSA 对猪核移植胚胎发育的影响  32-34
  3.2 TSA 不同处理时间对猪核移植胚胎发育的影响  34
  3.3 TSA 对不同供核细胞构建的重构胚发育的影响  34-38
    3.3.1 TSA 对同种核移植重构胚发育的影响  34-35
    3.3.2 TSA 对人猪异种核移植重构胚发育的影响  35-38
  3.4 TSA 对eGFP 转基因体细胞核移植胚胎发育及eGFP 表达的影响  38-42
    3.4.1 不同浓度TSA 处理12h 对eGFP 转基因体细胞核移植胚胎发育的影响  38-39
    3.4.2 TSA 对eGFP 转基因体细胞核移植胚胎发育的影响  39
    3.4.3 TSA 对转基因体细胞核移植胚胎eGFP 表达的影响  39-42
4 讨论  42-45
  4.1 TSA 处理浓度对重构胚发育的影响  42
  4.2 TSA 处理时间对重构胚发育的影响  42-43
  4.3 供体细胞遗传背景对重构胚发育的影响  43
  4.4 TSA 对异种核移植重构胚发育的影响  43-44
  4.5 外源转基因的重编程  44-45
5 结论  45-46
致谢  46-47
参考文献  47-55
附录  55-57
攻读硕士学位期间发表的文章  57

TSA浓度及处理时间对猪体细胞核移植胚胎体外发育及转基因eGFP表达的影响

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