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基于TEM-8新型颗粒性疫苗的构建、鉴定及其抗肿瘤免疫的研究

作　者: 刘平
导　师: 梁后杰
学　校: 第三军医大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 肿瘤 TEM-8 CTL 免疫治疗
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景和目的:实体瘤的生长和转移依赖于血管的生成,因此,抗肿瘤血管生成也成为抗肿瘤治疗的一种有效手段。目前,针对于VEGF为靶点的被动免疫抗血管生成的药物在临床上取得了一定进展后,随之而来的抗肿瘤血管生成治疗也在不断的深入,以激活细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)为主的主动免疫治疗策略在恶性肿瘤的综合治疗中发挥了重要作用。与其它传统的治疗方法相比较,主动免疫治疗能诱导自身的肿瘤特异性免疫应答,不但可以识别和清除肿瘤细胞,而且还可以诱发免疫记忆,阻止肿瘤的复发。同时能够减少持续给药给患者带来的麻烦和严重的经济负担。所以,抗肿瘤血管生成疫苗的运用前景非常具有吸引力。到目前为止,抗肿瘤血管生成的分子疫苗治疗中,靶抗原主要是VEGFR-2,VEGF,FGFR,MMP-2分子等,但是这些分子不仅在肿瘤细胞组织中表达丰富,而且在一些正常组织内表达量也较高,所以针对类似靶点设计的分子疫苗对自身有一定的潜在危害性。2000年Croix发现了9条在结肠癌血管内皮中特异性高表达的基因,分别命名为肿瘤内皮标志物1～9(tumor endothelial markers,TEMs)。经原位杂交检测发现,在成年小鼠体内,TEM-8的mRNA在正常组织中不表达或者微量表达,而在其肿瘤内皮中的表达却非常丰富。在人体内,TEM-8mRNA和TEM-8蛋白几乎在所有的结肠癌、食管癌、膀胱癌、肺癌病例中高表达,而在同一病例的癌旁组织和正常组织中却不表达,在黄体及伤口愈合过程中的新血管中也没有检测出TEM-8蛋白分子。这些研究结果提示TEM-8是目前最理想的免疫治疗候选靶点之一。在后来的分子疫苗研究中证实TEM-8所构成的单独的分子疫苗免疫原性较低,而与其他抗原结合以后可以有效的激发免疫反应,后来的学者在临床上引入DC疫苗后可以有效的提高TEM-8的免疫原性,抗瘤效果明显,但是存在转运效率不高,操作不方便,费用高等特点。阳离子肽类DNA转运载体(cationic peptides DNA delivery systems)是进展较快的领域之一。该类DNA转运载体为一些富含正电荷氨基酸的多肽,如多聚赖氨酸(ploylysine,[K]n),它们可通过电性中和作用与富含负电荷(磷酸根基团)的质粒DNA发生聚合、压缩,从而将直径约数百纳米、松散的质粒DNA聚缩成为几十纳米的致密颗粒,使之易于被真核细胞摄入从而达到基因转染的目的。构建“肽-DNA复合疫苗”,这种疫苗可以打破自身耐受,操作方便,是比较理想的选择之一。本课题的目的就在于评估基于TEM-8的分子疫苗经过阳离子穿膜肽改造后的抗肿瘤免疫治疗的有效性和毒副作用,从而评价是否有必要对TEM-8进行更多的免疫治疗方面的研究。方法:1.我们首先构建阳离子融合肽[K]16-tat49-57,融合肽经反相高压液相色谱鉴定其纯度,用质谱鉴定其分子量,在特定NaCl浓度下,将其与富含负电荷的pTEM-8真核表达质粒结合构建成新型颗粒性疫苗,用透射电镜扫描显示其颗粒大小,用westernblot检测TEM-8蛋白的表达;2.构建CT-26结肠癌模型,我们以基于TEM-8的新型颗粒性疫苗免疫Balb/c小鼠,研究疫苗的抗瘤能力。免疫小鼠每周一次,连续三次。观察小鼠的生存时间和肿瘤体积变化情况,用免疫组化观察肿瘤组织血管生长情况,并计算肿瘤微血管密度;3.确认了疫苗的抗肿瘤作用之后,我们进一步研究了疫苗的抗肿瘤机理和毒副作用;结果:1.对合成的多肽进行高效液相色谱鉴定其纯度达到了96.57%用质谱分析其分子量为3390.44 Da,并成功构建了颗粒性疫苗,透射电镜及软件分析,其颗粒大小均匀,直径小于25nm,符合疫苗要求,并对其转染和免疫印迹检测分子量为63KD符合预期结果;2.实验结果显示,基于TEM-8的颗粒性疫苗免疫组的肿瘤体积与对照组有明显差异(p<0.05),荷瘤小鼠生存期延长。肿瘤组织内血管内皮细胞采用抗CD31单克隆抗体作免疫组织化学染色,结果显示TEM-8疫苗免疫组微血管密度(MVD)较对照组明显降低;3.在激发CTL的51Cr释放实验证明,经过疫苗免疫的小鼠能够激发CTL免疫反应,ELISPOT检测显示在体内疫苗能有效激发抗原特异性CTL效应,分别利用抗CD4+或者抗CD8+单抗作保护性免疫试验,结果发现抗CD8+时,小鼠不能获得疫苗免疫后的保护性效果;而在抗CD4+时,实验组和对照组小鼠肿瘤体积仍然有显著性差异(p<0.05),提示CD8+T细胞在抗肿瘤中起主要作用;结论:1.成功构建基于TEM-8的新型颗粒性疫苗,同时能够有效介导基因的表达;2.基于TEM-8的颗粒性疫苗能有效抑制肿瘤的生长速度、提高荷瘤动物的生存率;3.CD8+T细胞在以DNA疫苗所诱导的抗肿瘤免疫应答中起主要作用;

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英文缩略词一览表  5-7
英文摘要  7-10
中文摘要  10-13
论文正文基于TEM-8 新型颗粒性疫苗的构建、鉴定及其抗肿瘤免疫的研究  13-56
  前言  13-15
  第一部分基于TEM-8 新型颗粒性抗肿瘤血管生成疫苗的分子设计  15-18
    一、基于TEM-8 的新型颗粒性疫苗的设计原理  15
    二、阳离子穿膜肽的应用及其改建  15-16
    三、TEM-8 基因的应用  16-18
  第二部分基于TEM-8 的新型颗粒性抗血管生成疫苗的制备与鉴定  18-32
    一、多肽的合成与鉴定  18-20
      材料和方法  18
      结果  18-20
    二、质粒制备与鉴定  20-25
      材料和方法  20-24
      结果  24-25
    三、颗粒性疫苗的制备与鉴定  25-31
      材料与方法  25-28
      结果  28-31
    讨论  31-32
  第三部分基于TEM-8 新型颗粒性抗肿瘤血管生成疫苗体内抗肿瘤作用研究  32-47
    材料与方法  32-36
    结果  36-44
    讨论  44-47
  全文结论  47-48
  致谢  48-49
  参考文献  49-56
文献综述提高 DNA 疫苗免疫原性策略的研究进展  56-64
  参考文献  62-64
硕士在读期间发表的论文  64

基于TEM-8新型颗粒性疫苗的构建、鉴定及其抗肿瘤免疫的研究

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