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内源性干细胞动员治疗大鼠脑梗死时间窗的实验研究

作　者: 刘春芹
导　师: 李永秋
学　校: 河北医科大学
专　业: 神经病学
关键词: 骨髓干细胞 粒细胞集落刺激因子 SD大鼠 脑梗死 内源性动员 凋亡
分类号: R743.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的:目前应用干细胞治疗脑缺血的实验研究已经取得了初步成果,业已经证明重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor ,rhG-CSF)在脑缺血时可动员骨髓干细胞入血并迁移至神经系统分化为神经细胞。但以往的动物实验多是在脑梗死即刻给予rhG-CSF进行疗效观察,而脑梗死患者就诊时间不同,不同时间窗给药是否会影响治疗效果尚无实验研究。本实验是在大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型制作成功后不同时间窗内,给予实验组大鼠皮下注射rhG-CSF,动态观察大鼠神经功能恢复情况,比较不同时间窗给予rhG-CSF对脑梗死的治疗效果,探讨临床最佳的治疗时间;以5-溴-2-脱氧尿苷(5-bromodeoxyuridine,Brdu)标记动员后处于增殖状态的干细胞,观察骨髓干细胞的迁移、分化,并进行细胞计数、梗死体积测量和检测凋亡相关因子探讨rhG-CSF改善脑梗死预后的可能机制。方法:1选取280~320g健康雄性SD大鼠,根据改良后的Longa线栓法建立大鼠大脑中动脉脑栓塞模型,将模型制作成功的大鼠随机分为24小时、72小时、7天3个给药时间点组,每个时间点组又随机分为实验组和对照组,每组24只大鼠。24小时给药实验组为A组、对照组为a组, 72小时给药实验组、对照组分别为B组和b组,7天给药实验组、对照组分别为C组和c组。实验组颈部皮下注射rhG-CSF,首剂20ug/Kg,以后rhG-CSF 10ug/Kg/天皮下注射,连续应用5天,同时给予Brdu 50mg/kg/天腹腔注射,连续应用至取材日。对照组颈部皮下注射等量生理盐水,Brdu 50mg/kg腹腔注射,连续应用至取材日。每组分别于给药后5天、14天、21天取大鼠脑组织。5天取材经检测CD34+抗原免疫组化了解内源性动员后骨髓干细胞的动员情况,经bcl-2/bax抗原免疫组化了解神经细胞凋亡情况。14天、21天取材通过GFAP/Brdu、Nestin/Brdu、Nse/Brdu双染免疫组化了解干细胞分化情况,经bcl-2/bax抗原免疫组化了解神经细胞凋亡情况。每组于给药后21天取材经氯化三苯基四氮唑(2,3,5,-triphenyltetrazoliumchloride,TTC)染色观察大鼠脑梗死体积。各组于给药后5天、14天、21天通过神经功能缺损评分(Neurological Severity Scores,NSS)了解大鼠神经功能情况。2统计学分析:应用SAS V8进行统计分析,所有统计结果均以均数±标准差( x±s)表示。多样本均数比较采用完全随机方差分析,两样本比较采用两样本均数比较的t检验。死亡率采用多个样本率比较的χ2检验。按a=0.05作为检验水准,对资料进行统计分析。结果:1死亡率:1.1模型制作成功后死亡率:A组(20%)与a组(38.5%),B组(38.5%)与b组(42.6%),C组(40%)与c组(41.5%),死亡率无显著性差别(P>0.05);a组、b组、c组死亡率无显著性差别(P>0.05);A组、B组、C组死亡率无显著性差别(P>0.05)。1.2给药后死亡率:A组死亡率4%,a组死亡率8%,二者无显著性差别(P>0.05)。B组、b组、C组、c组均为0。A组、B组、C组无显著性差别(P>0.05),a组、b组、c组无显著性差别(P>0.05)。2神经功能缺损评分:2.1 5天、14天、21天2.1.1 A组<a组,B组<b组,C组<c组,均具有显著性差别(p<0.05)。2.1.2 A组、B组、C组三组间无显著性差别(P>0.05)。2.2 A、B、C各组在给药后第14天与第21天NSS评分无显著性差别(p>0.05)。3梗死体积:3.1 A组(143.75±19.28)<a组(181.67±28.00),B组(164.58±28.13)<b组(210.42±35.37)有显著性差别(P<0.05) , C组(195.00±34.96 )、c组(191.67±41.16)无显著性差别(P>0.05)。3.2 a组、b组、c组,三组无显著性差别(P>0.05)。3.3 A组与B组无显著性差别(P>0.05),小于C组,有显著性差别,(P<0.05)。4免疫组化结果:4.1 CD34+:4.1.1 A组>a组,B组>b组,C组>c组,均具有显著性差别(p<0.05)。4.1.2 a组、b组、c组仅有少量散在CD34+阳性细胞表达,三组无显著性差别(p>0.05)。4.1.3 A组、B组、C组均可见较多的CD34+阳性细胞表达,主要位于梗死灶周围区域,三组无显著性差别(p>0.05)。4.2 Bcl-2:5天、14天、21天取材4.2.1 A组>a组,B组>b组,C组>c组,均具有有显著性差别(p<0.05)。4.2.2 a组、b组、c组均有少量Bcl-2阳性细胞表达,三组无显著性差别(p>0.05)。4.2.3 A组、B组、C组均有较多Bcl-2阳性细胞表达,主要位于梗死灶周围,三组无显著性差别(p>0.05)。4.3 Bax:5天、14天、21天取材4.3.1 A组<a组,B组<b组,C组<c组,均有显著性差别(p<0.05)。4.3.2 a组、b组、c组均有较多bax阳性细胞表达,位于梗死灶周围区域,三组无显著性差别(p>0.05)。4.3.3 A组、B组、C组均有少量bax阳性细胞表达,主要位于梗死灶周围区域,三组无显著性差别(p>0.05)。4.4 GFAP/Brdu:14天、21天取材4.4.1 A组<a组,B组<b组,C组<c组,GFAP有显著性差别(p<0.05)。4.4.2 a组、b组、c组均有较多GFAP/Brdu阳性细胞表达,主要位于梗死周围区域,但海马、对侧大脑半球也有少量表达,三组无显著性差别(p>0.05)。4.4.3 A组、B组、C组仅有少量GFAP/Brdu阳性细胞表达,主要位于梗死灶周围区域,三组无显著性差别(p>0.05)。4.5 NSE/Brdu:14天、21天取材4.5.1 A组>a组,B组>b组,C组>c组,均有显著性差别(p<0.05)。4.5.2 a组、b组、c组均有少量NSE/Brdu阳性细胞表达,三组无显著性差别(p>0.05)4.5.3 A组、B组、C组均有较多的NSE/Brdu阳性细胞表达,主要位于梗死周围区域,但海马、对侧大脑半球也有少量表达,三组无显著性差别(p>0.05)。4.6 Nestin/Brdu:14天、21天取材4.6.1 A组>a组,B组>b组,C组>c组,均有显著性差别(p<0.05)。4.6.2 a组、b组、c组均有少量Nestin/Brdu阳性细胞表达,三组无显著性差别(p>0.05)4.6.3 A组、B组、C组均有较多的Nestin/Brdu阳性细胞表达,主要位于梗死周围区域,但海马、对侧大脑半球也有少量表达,三组无显著性差别(p>0.05)。结论:1脑梗死后给予rhG-CSF可动员骨髓干细胞并向梗死灶周边聚集,进一步分化为神经干细胞及神经细胞。2脑梗死后给予rhG-CSF可增加抗凋亡基因表达,抑制促凋亡基因表达。3脑梗死后72小时内给予rhG-CSF可缩小梗死体积。4脑梗死后给予rhG-CSF可改善脑梗死大鼠模型神经功能缺损,但24小时、72小时、7天给药疗效无差别。

全文目录


中文摘要  4-8
英文摘要  8-13
研究论文 内源性干细胞动员治疗大鼠脑梗死时间窗的实验研究  13-86
  前言  13-14
  材料与方法  14-19
  结果  19-24
  附图  24-69
  附表  69-78
  讨论  78-83
  参考文献  83-86
综述 内源性干细胞动员治疗脑梗死的研究进展  86-95
致谢  95-96
个人简历  96

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